基于具有点击化学活性的环二核苷酸探针分子深入研究环二核苷酸的生理功能

Bacteria-derived cyclic dinucleotides are considered as promising potent adjuvants in vaccination because they can stimulate the innate immune response in mammalian host cells. However, the discovery of cGAMP(2'-5') demonstrates that mammalian cells can also generate endogenous cyclic dinucleotide, which is a secondary messenger in cGAS-STING pathway for innate immune response. As the receptor protein beyond the immune system, HCN4 can be regulated by cGAMP(2'-5') to affect heart rate. This indicates that there might be more potential receptor proteins of cGAMP(2'-5'), other than STING and HCN4, with unknown biological functions. This project will apply clickable and photo-crosslinkable derivatives of cGAMP(2'-5') as molecular probes, to label and identify all potential receptor proteins of cGAMP(2'-5'). By this unique chemical biology strategy, it would unveil the mystery of cGAMP(2'-5') receptor proteins and elucidate the regulatory mechanism of cGAMP(2'-5') in immune diseases and neurodegenerative diseases, which will bring more comprehensive understanding of biological functions of cGAMP(2'-5'). This might also provide the novel strategies and tools for immunotherapy.

细菌衍生的环二核苷酸能激活哺乳动物宿主细胞的先天性免疫反应，被认为是治疗耐药菌感染的极具潜力的免疫治疗剂。然而cGAMP(2'-5')的发现证实了哺乳动物细胞自身同样能够生成内源性环二核苷酸，并且在先天性免疫信号通路cGAS-STING中发挥着非常重要的第二信使作用。HCN4作为cGAMP(2'-5')在免疫系统之外的另一个受体蛋白，调控着心率，暗示cGAMP(2'-5')可能有其它受体蛋白和其它未知的生物功能。本课题将应用具有点击化学活性和光交联性质的cGAMP(2'-5')探针分子，对cGAMP(2'-5')潜在的受体蛋白进行全面地标记和鉴定，阐明cGAMP(2'-5')调控这些受体蛋白功能的机理。通过上述独特的化学生物学方式将有望发现并揭示cGAMP(2'-5')更多的生物功能，以及在免疫性疾病和神经退化性疾病中的调控机制，从而为寻找新型的免疫治疗方法提供新思路。

环二核苷酸2’3’-cGAMP作为哺乳动物细胞里的第二信使在天然免疫响应中起着非常重要的作用。2’3’-cGAMP能与STING结合引发下游的干扰素和促炎因子的转录水平的上调，来达到去除细胞质DNA这一危险信号。因此关于2’3’-cGAMP的研究绝大多数都是围绕着2’3’-cGAMP的受体蛋白STING进行的。鉴于目前没有一个很有效可行的方法，对于2’3’-cGAMP结合蛋白的认知十分不足。因此申请人设计并利用化学方法合成了2’3’-cGAMP几种光亲和探针分子，来全面鉴定出其在哺乳动物细胞中的结合蛋白，以此来加深和拓宽对2’3’-cGAMP生物功能及其调控机制的了解，有利于为免疫相关疾病提供新的思路和手段。.申请人利用2’3’-cGAMP光亲和探针分子，结合化学生物学手段，在不同的哺乳动物细胞裂解液进行了潜在结合蛋白的鉴定，并对其中一个结合蛋白EF1A1进行了验证。实验结果证实了EF1A1蛋白能与2’3’-cGAMP在体外和细胞内进行高效的结合，和已知受体蛋白STING与2’3’-cGAMP的结合相当，表明EF1A1与2’3’-cGAMP的结合很可能是生理相关的。进一步的研究表明，2’3’-cGAMP倾向与蛋白生物合成延伸过程EF1 complex中的EF1A1结合，而不是游离的EF1A1，并占据了其GTP结合位置，阻止了其与GTP的结合及引起的活化，延缓了EF1A1从EF1 complex中解离并转移到核糖体上的过程，会干扰蛋白生物合成。Puromycin标记蛋白合成实验验证了外源2’3’-cGAMP确实能抑制THP-1细胞的蛋白生物合成，并且这一过程与STING无关，说明这是2’3’-cGAMP不依赖于STING的新的生物功能。.这项研究表明2’3’-cGAMP光亲和探针分子为鉴定和验证2’3’-cGAMP的结合蛋白提供了一种有效便捷的手段。EF1A1被发现是新的2’3’-cGAMP结合蛋白为细胞中存在着其它2’3’-cGAMP结合蛋白提供了有力证据，并且2’3’-cGAMP通过结合EF1A1抑制蛋白生物合成是不依赖于STING的新的生物功能，这为探究2’3’-cGAMP及细菌衍生的环二核苷酸的未知生物功能开拓了新的领域和契机。此外，2’3’-cGAMP作为EF1A1结合的内源性代谢小分子为研发新型的EF1A1抑制剂来调控蛋白生物合成提供了新的思路。