环二核苷酸激活猪STING蛋白信号通路的分子机制

STING (stimulator of interferon genes) is a novel regulatory protein in innate immune signaling pathways, which has been shown to be essential for the production of type Ⅰ interferon in response to certain viruses and intracellular bacteria.STING can be a PRR of the cyclic dinucleotides to induce type Ⅰ interferon response,through recruitingTBK1 to activate IRF3. Activation of STING by cyclic dinucleotides /CDNs innate immune in different organisms differs a lot, which reminds us that the innate immune signaling pathway still need to be explored. Due to the importance of STING signaling pathway and the potential of CDNs to be a new immunopotentiator, our project is aimed to solve the structures of c-di-GMP ,c-di-AMP,2'5'-CGAMP,3'5'-CGAMP with STING via X-ray crystallography method and elucidate the molecule mechanism of the difference between the activation of STING from different ligands via structural alignment and biochemical analysis. At the same time, in vitro study on the immune enhancing effect of CDNs on PAM will be carried out. We expect to provide new view for the new immunopotentiator.

STING蛋白是天然免疫信号通路中重要的接头分子，在防御细菌及病毒感染、介导Ⅰ型 IFN 产生过程中发挥重要功能。STING 则可以直接作为环二核苷酸的模式识别受体, 招募 TBK1 激活 IRF3，引发Ⅰ型干扰素反应。环二核苷酸激活不同物种STING蛋白存在着明显差异，这提示我们，环二核苷酸激活STING天然免疫信号通路尚且存在未知的特性。鉴于STING天然免疫信号通路的重要性及环二核苷酸作为免疫增强剂研究的新热点，本项目拟借助X射线晶体学手段，对c-di-GMP 、c-di-AMP、2'5'-CGAMP、3'5'-CGAMP配体与猪STING蛋白复合物进行三维结构解析，通过结构比对，生化分析等试验，分析不同配体激活STING信号通路的差异，并阐明其分子机理。同时，通过体外实验，研究环二核苷酸对猪源细胞的免疫增强作用。期望为针对猪的新型免疫增强剂的研究提供新的视角。

环二核苷酸（Cyclic dinucleotides/CDNs），如c-di-GMP 和c-di-AMP 是细菌中广泛存在的第二信使，它们不存在于高等生物中。在真核细胞中存在cGAS 酶，cGAS 可以在dsDNA 存在的条件下利用ATP 和GTP 合成杂交的c-AMP-GMP(2'3'-cGAMP)，2'3'-cGAMP 第二信使的发现填补了从DNA sensor 到STING 信号转导的空白。当CDNs进入细胞内，能通过 STING-TBK1-IRF3信号通路产生I 型干扰素，而提高机体的天然免疫。本研究利用改造的核苷酸环化酶DncV（VC0179）,实现VC0179-ΔLOOP的活性可溶性表达。改造后的VC0179,在酶的活性和产物生成效率方面都有很大的提高。提高GTP、ATP的利用率，减少酶的损耗，很大程度上降低了小分子的生产成本,可以完成c-di-GMP, c-di-AMP and 3’3’-cGAMP三种小分子制备与纯化。本研究还利用鼠源mcGAS蛋白作为酶催化合成2'3'-cGAMP小分子，并成功制备纯化获得高纯度的2'3'-cGAMP小分子。四种小分子的制备产品，完全可以满足蛋白结晶对配体的要求。.在高等生物天然免疫系统中，STING蛋白是细胞内对双链DNA（dsDNA）免疫应答的重要接头分子。cGAS-STING通路在胞质双链DNA (dsDNA)检测中起着重要作用。dsDNA活化的cGAS会产生第二信使环GMP (2'，5')-AMP (3'，5') (2'，3'cGAMP)，与c-di-GMP、c-di-AMP、3’3’cGAMP等细菌环二核苷酸(CDNs)相比，与STING结合亲和力更高。尽管有进展表明二聚体STING CBD优先结合不对称的2’，3’cGAMP而非对称的3’，3’CDNs，但STING分子，如人STING，采用对称的二聚体构象有效地结合其不对称配体仍是一个有待解决的问题。CDNs信号通路使我们对STING介导的dsDNA信号通路的认识更加深入。我们借助X-射线晶体学的方法解析了猪源STING蛋白的C端结构域（CTD）上的STING CDN-binding domain (CBD)分别与第二信使c-di-GMP, c-di-AMP and 3’3’-cGAMP、2’3’-cGAMP形成复合物的三维空间结构。研究表明2’3’-c