β-catenin与内皮型一氧化氮合酶的相互作用及其对动脉粥样硬化内皮损伤的影响

Atherosclerosis is a cause of much morbidity and mortality in the whole world, and is characterised by dysfunction of the vascular endothelium. Endothelial nitric oxide synthase (eNOS) is the main vascular source of the vasorelaxant and anti-atherogenic mediator nitric oxide (NO), and is widely accepted to offer protection from cardiovascular disease. We have recently demonstrated in endothelial cells a novel interaction of eNOS with β-catenin, a component of the adherens junction as well as participant in the Wnt signalling pathway, which causes β-catenin to translocate to the nucleus with consequent effects on increasing TCF activity, releasing proinflammatory molecules and worsening the dysfunction of endothelium induced by atherosclersis. There is no report about the interactions between eNOS and β-catenin up to date. Thus, we propose here to investigate in detail the role of β-catenin in mediating eNOS activity in the endothelium, specifically on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), human coronary artery endothelial cells (HAVEC) and ApoE-/- atherosclerotic mice model, through the techniques of biochemistry and molecular biology. The significance of our research is to discover the novel mechanism of eNOS regulating from a distinguish aspect of β-catenin, as well as the importance of this in endothelium dysfunction in atherosclerosis.

动脉粥样硬化（AS）是致死致残率极高的疾病之一，其特征病理改变为血管内皮功能障碍。一氧化氮（NO）是重要的舒血管因子，具有抗动脉粥化硬化（AS）作用，内皮型一氧化氮合酶（eNOS）被公认为对心血管系统起保护作用。β-catenin是一种多功能蛋白质，经典Wnt信号通路的激活能促进β-catenin进入细胞核，使TCF活性增加，增加促炎因子的表达，加重AS对内皮的损伤。我们的预实验结果发现，β-catenin能与eNOS结合，同时eNOS的激动剂能增加两者的结合，在AS的动物模型中，主动脉eNOS 磷酸化水平的下降不依赖于PI3K/Akt通路。本研究拟运用分子生物学等技术，在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人冠状动脉内皮细胞（HAVEC）及apoE-/-小鼠等动物模型中进一步研究两者的结合对eNOS的活性及β-catenin核转位与TCF的结合的影响，为AS损伤内皮的治疗提供新的思路。

血管内皮功能障碍是动脉粥样硬化（AS）特征性病理改变，主要表现为一氧化氮（NO）生物利用度下降。内皮型一氧化氮合酶（eNOS）是NO生成的限速酶。氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）是血管内皮细胞损伤过程中的起始因子。腺苷、组胺及沙丁胺醇等通过Ca2+依赖或非依赖途径调节eNOS的活性，而热休克蛋白90、钙调蛋白等与eNOS相互作用，调节其活性。我们的预实验发现：在内皮细胞上β-catenin能与eNOS结合，且eNOS的激动剂降低二者的结合。β-catenin是一种多功能蛋白质，其转核后与T细胞因子/淋巴细胞增强因子（TCF/LEF）相互作用，且TCF/LEF活性的增加参与AS早期病变的发生。该课题在于验证科学假说：在动脉粥样硬化内皮损伤中，β-catenin与eNOS结合增加，降低eNOS源性的NO生成，增加β-catenin核转位及其与TCF/LEF的结合，增加促炎因子释放，从而加重内皮功能损伤。本课题以ox-LDL诱导内皮细胞损伤，免疫共沉淀发现，eNOS的激动剂显著减少β-catenin与eNOS的结合，而ox-LDL使eNOS活性降低的同时促进iNOS的表达，NO产生增加，β-catenin与eNOS结合增加，用NOS抑制剂预处理则降低二者的结合。用巯基亚硝基化（SNO）检测试剂盒发现ox-LDL作用下，eNOS-SNO增加。转染野生型eNOS及其突变体Ser1177A（丝氨酸突变为丙氨酸，不能被磷酸化即无活性的eNOS）和Ser1177D（丝氨酸突变为天冬氨酸，模拟Ser1177磷酸化,即有活性eNOS）质粒入HEK-293细胞后，与野生型比，转染Ser1177D显著减少二者的结合，而转染Ser1177A使二者结合增加。在EA.hy926细胞中，提取细胞核蛋白，用免疫印迹的方法显示ox-LDL增加核内eNOS与β-catenin的含量。以上结果提示，ox-LDL作用内皮细胞后，由于抑制eNOS的同时促进iNOS的表达，NO产生增加，从而使eNOS发生巯基亚硝基化修饰，进一步降低eNOS的活性，导致无活性的eNOS增加，促进无活性的eNOS和β-catenin结合从而共同入核，导致内皮细胞损伤。后续将在apoE-/-小鼠AS模型上进一步验证。这一发现提示，干预eNOS与β-catenin的结合可能为动脉粥样硬化的治疗提供靶点，为心血管疾病的防治提供新思路。