在单个活细胞上对脂筏纳米结构进行三维动态纳米成像并研究其变化对衰老细胞的影响

Lipid rafts are sphingolipid- and cholesterol-enriched nanoscale domains (10-200nm) floating within the plasma membrane and fluctuating in size and composition. Rafts are highly-packed and in a rigid liquid crystal state that is distinct from the disordered fluid phase of the surrounding phospholipid on the plasma membrane. .The classic biochemical method for lipid raft study is membrane extraction, which is complicated and might change properties of rafts. The widely-available confocal microscopy provides a spatial resolution (about 250 nm) insufficient for observing the details of rafts with a diameter of (10-200 nm). As such, although abnormal rafts.have been observed in cellular senescence and aging, little evidence related to raft nanostructure alteration is obtained from single live cells. The non-scanning wide-field fluorescence and 3D dynamic nanoresolution tracing system established in Prof. NIU Hanben’s lab is a newly-developed equipment for providing high-speed,3D ,and dynamic nanoresolution. In our preliminary study using this system, we stained lipid rafts on observed clear pictures of rafts at resolution of about 20nm. In the proposed study, we will establish the method for directly visulization of raft nanostructure and 3D dynamic features. We will characterize the nanostructure and 3D dynamic features of normal rafts and the detailed alteration of these raft nanoscale features in single live cells. Consequently, we will reveal how abnormal rafts in senescent cells has a effect on cell function.

脂筏是真核细胞质膜上的纳米结构，富含胆固醇和神经节苷脂，内部镶嵌各种蛋白（如生长因子受体）。多种信号分子被招募和组织到脂筏的胞内侧，因此脂筏作为信号传输平台参与了细胞内信号转导。目前研究脂筏的常用方法有提取分离法和共聚焦显微镜法。由于脂筏大小约10-200纳米，已有技术不能在单个活细胞上获得脂筏详细特征。因此，尽管已有报道揭示衰老细胞及个体上脂筏成分出现异常，目前仍然不能在单个活细胞上揭示细胞衰老中脂筏纳米特征发生的具体变化。拟将用于本项目的非扫描荧光纳米显微及三维动态追踪系统是当前最先进的成像技术之一，能够为单个活细胞提供三维动态纳米分辨率；应用该系统我们已初步获得脂筏的纳米结构。本项目将应用该系统全面建立起在单个活细胞上获得脂筏的纳米结构和三维动态纳米特征的方法；并且在单个活细胞上揭示正常脂筏的纳米特征以及细胞衰老过程中脂筏纳米特征的变化；最终阐明衰老细胞中异常的脂筏如何影响细胞功能。

脂筏是真核细胞质膜上的纳米结构（10-200纳米）；富含饱和脂类、胆固醇和神经鞘脂，因此内部结构高度有序和压缩，处于液体晶体状态。同时，脂筏中嵌有多种跨膜蛋白，在细胞内侧通过GPI锚定蛋白招募并组织各种细胞内信号因子，从而起到信号平台的作用；因此，脂筏对正常细胞生命非常重要，它的某些改变能够导致异常的信号转导，最终引起病理反应。迄今为止对脂筏的研究主要采用生物化学方法或共聚焦荧光显微法。用生化方式研究脂筏容易在分离过程中改变脂筏的特性，方法本身比较复杂，无法提供单个细胞上脂筏的信息。共聚焦显微镜为脂筏存在于细胞质膜上提供重要证据，但其的空间分辨率（250nm）不足于观察直径只有10-200 nm的脂筏的详细结构。本项目所基于的非扫描荧光纳米显微系统（原深圳大学光电工程学院牛憨笨教授领导建立的）是当前世界上最先进的超分辨成像技术之一。在本基金的支持下，我们排除不可避免的纵向、横向漂移影响，摸索到在细胞上三维纳米成像的最优条件，建立一种针对脂筏的单分子成像方法，实现了在单个的活细胞质膜上对脂筏的纳米结构成像。在此基础上，我们应用一系列正常的人类或小鼠细胞， 在纳米尺度上揭示不同种类细胞脂筏的结构特征。进一步，我们利用博來微素（bleomycine）诱导细胞人类皮肤的正常成纤维细胞衰老，并在所建立的纳米分辨平台上研究正常和衰老细胞上的脂筏，揭示细胞衰老过程中脂筏纳米结构特征的变化。最后，我们在纳米分辨尺度上，通过对脂筏以及各种细胞质膜上受体（比如成纤维细胞生长因子受体）进行双色成像，揭示不同胞内信号通路如何以脂筏为信号平台影响细胞身份转换。部分结果已经发表于2017年eLife (6:e21660,本申请人是第一作者和共同通讯作者)，有另外一部分工作已写成文章，准备投稿 （本申请人是通讯作者，本基金是第一致谢基金）。