羊水间充质干细胞在体外定向分化为Ⅱ型肺泡上皮细胞及其在吸烟大鼠肺组织修复中的作用的研究

修复损伤的肺组织、使丢失的肺泡再生是慢性阻塞性肺疾病（COPD）治疗的关键所在。Ⅱ型肺泡上皮细胞（ATⅡ）是Ⅰ型肺泡上皮细胞的祖细胞，在肺组织的修复中发挥着重要作用。胚胎干细胞可在体外分化为ATⅡ，但其研究受到伦理学限制。羊水间充质干细胞（AF-MSC）是一种具有广泛潜能的种子细胞，但目前尚无AF-MSC在体外分化为ATⅡ的报道。吸烟是引起COPD肺组织损伤的重要诱因，但AF-MSC在吸烟所致的肺组织损伤的修复中的作用未见报道。因此，本课题从产后羊水中分离AF-MSC，通过基因修饰、小气道基础培养基培养等技术诱导AF-MSC在体外的定向分化，以电镜、RT-PCR等方法研究AF-MSC是否在体外定向分化为ATⅡ，并将AF-MSC移植入吸烟大鼠体内，通过Y-FISH、免疫荧光等方法研究AF-MSC在吸烟大鼠体内的分化及其在吸烟所致的肺组织损伤的修复的作用，为COPD的干细胞治疗奠定基础。

修复损伤的肺组织、使丢失的肺泡再生是慢性阻塞性肺疾病（COPD）治疗的关键所在。II型肺泡上皮细胞（AECII）是I型肺泡上皮细胞的祖细胞，在肺组织的损伤修复中发挥着重要作用。本项目探讨羊水间充质干细胞（AF-MSC）在体外与体内能否定向分化为AECII及其在肺气肿大鼠肺组织的损伤修复中的作用。经研究我们发现：（1）AF-MSC可显著表达CD29、CD44、CD73、CD90 、CD105、CD166及OCT-4，不表达CD14、CD19、CD34及CD45；AF-MSC在体外可诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞，具有良好的分化潜能；（2）AF-MSC在KnockOut™ 替代血清（KOSR）、activin A及小气道培养基（SABM）的适当诱导条件下可显著表达SPA、SPB、SPC、SPD和TTF1，电镜下发现嗜锇性板层小体。其结果表明AF-MSC在体外可定向分化为AECII；（3）转染pcDNA3.1/SPC/EGFP重组质粒的AF-MSC在KOSR、activin A及SABM等的适当诱导下可向AECII定向分化，并表达SPC等，且在荧光显微镜下出现绿色荧光。其结果表明pcDNA3.1/SPC/EGFP可能成为跟踪AF-MSC定向分化的工具；（4）将雄性胎鼠来源的AF-MSC移植至雌性肺气肿大鼠体内，经Y-FISH与SPC双重荧光染色发现肺气肿大鼠肺组织同时存在Y染色体阳性并表达SPC的细胞，且其肺功能、肺组织病理及AECII凋亡等情况均显著改善。其结果表明AF-MSC在肺气肿大鼠肺组织中可定向分化为AECII，并起到肺组织损伤修复作用，为深入研究COPD的干细胞治疗奠定基础。