基因修饰羊水间充质干细胞对兔缺血再灌注损伤心肌的修复作用及其在体外联合诱导定向分化为心肌细胞的研究

对急性心肌梗塞的再灌注治疗已经成为一种重要且不可或缺的方法，然而对于随之而来的再灌注损伤目前无切实、有效的方法，如何使心肌梗塞、缺血再灌注后坏死损伤心肌再生修复是当今心血管医学界迫切需要解决的问题之一。找到优良的干细胞、使干细胞尽量多的转化成心肌细胞、使干细胞在缺血缺氧的心肌环境中更多的生存是目前干细胞治疗和再生医学迫切需要解决的关键科技问题之一。针对上述问题，我们选用优良新型的羊水间充质干细胞，用联合诱导的方法提高羊水干细胞转化为心肌细胞的转化率，用基因修饰转染的方法来提高羊水干细胞耐缺血缺氧能力，增加其在缺血缺氧心肌的环境中的存活率，以提高羊水干细胞对损伤坏死心肌的修复治疗作用。国内外还未见报道。如果实验成功，将找到用于坏死损伤心肌再生和修复的新方法，提高冠心病心肌梗塞的疗效和预后，从而为心血管疾病的干细胞治疗奠定坚实的基础。

心肌缺血再灌注损伤是当今心血管界迫切需要解决的问题之一。目前干细胞学研究的突破性进展，为缺血再灌注损伤的治疗带来了希望。羊水干细胞是较成体干细胞更原始的一类细胞，具备更强的体外增殖分化能力。目前羊水干细胞用于治疗缺血再灌注损伤心肌尚未见报道。本研究采用5-氮胞苷和转录生长因子β1对AFMSC进行联合诱导分化,以提高AFMSC的分化效能；用Akt基因修饰转染AFMSC后移植到缺血再灌注损伤兔心肌，研究其对损伤心肌的修复作用。本研究发现羊水间充质干细胞表达干细胞全能基因OCT4蛋白阳性，提示羊水间充质干细胞是一种多能干细胞。AFMSC经过诱导分化后可见表达GATA4、cTnT和Cx43；电镜下可见肌丝样等心肌细胞特异性结构，且在联合诱导组中的表达水平较其他组明显升高，表明联合诱导AFMSC分化为心肌样细胞更加高效。本实验成功提供了羊水间充质干细胞在体外定向分化为心肌细胞的高效可行方案。通过构建兔Akt过表达慢病毒载体，将Akt 基因转染羊水间充质干细胞，通过Western Blot验证过表达效果。在体外实验中通过Western Blot显示在缺氧的体外环境中Akt-AFMSCs表达P-Akt水平和存活率明显高于空病毒转染的羊水间充质干细胞（null-AFMSCs）；Real-time PCR检查发现Akt-AFMSCs较null-AFMSCs分泌更多的细胞因子。可见Akt-AFMSCs在体外对缺氧环境更具耐受力。体内实验表明移植后21天Akt-AFMSCs组EF明显高于对照组和null-AFSCs组。免疫荧光显示Akt-AFMSCs组缺血再灌注心肌中残存的羊水干细胞较多。Akt-AFMSCs组比 null-AFMSCs组梗死面积减少29%。与对照组和null-AFMSCs组比较，免疫组化显示Akt-AFMSCs 组微血管数量和cTNT表达明显增多，心肌细胞凋亡数量明显减少，缺血再灌注心肌组织中p-Akt、bcl-2、VEGF、connexin-43 蛋白表达较高，caspase-3蛋白表达减低。移植Akt-AFMSCs能显著降低MDA、NO、3-NO水平，增加SOD活力。可见Akt基因转染羊水干细胞移植可改善兔心肌缺血再灌注损伤后的心功能，其可能通过减少心肌细胞凋亡、分泌细胞因子、促进血管新生起作用。本研究有利于找到坏死损伤心肌再生和修复的新方法，提高疗效。