甲型H1N1流感病毒HA、NA和 M2蛋白的B细胞线性抗原表位扫描作图及其保守性和保护性表位分析鉴定

Influenza A (H1N1) virus is a highly pathogenic virus with serious threat to human health. Mapping of all the linear B cell epitopes on the encoded proteins of target virus is a meaningful basic application research, which plays a significant role in developing sensitive and rapid influenza diagnostic epitope peptide markers as well as new "general" multiple epitope peptide influenza vaccine. Using anti recombinant target protein polyclonal antibody and improved biosynthetic peptide method we have established, this project will identify all the linear B cell epitopes on influenza A (H1N1) HA, NA and M2 proteins and make a complete and accurate linear B cell epitope map of these proteins. We will further screen antibody-neutralizing or protective epitopes using serums of A/H1N1 vaccine inoculated volunteers and 8mer peptide fusion proteins containing identified minimal motifs of epitopes. In the meantime, we will seek 100% or highly conserved linear B cell epitopes (the rest will be determined as type-specific epitopes) among all the identified epieopes through homologous protein sequence comparison. The former conserved epitopes can be used in developing "general" preventive multiple epitope peptide influenza vaccine, while the latter can be used in developing specific multiple epitope peptide antigen for clinical diagnosis. This project will be the first innovative epitomics research practice on the three target proteins of influenza virus.

甲型H1N1流感病毒是严重威胁人类健康的高致病性病毒。为能研制灵敏快速的流感诊断表位肽标志物以及新型和"通用"多表位肽流感疫苗，阐明靶病毒编码蛋白的所有B细胞线性抗原表位是一项十分有意义的应用基础研究。本项目将用抗重组靶蛋白多抗和我们已建立的改良生物合成肽法，对甲型H1N1病毒HA 、NA和M2蛋白进行B细胞线性抗原表位扫描作图定位，绘制HA 、NA和M2蛋白完整且精细的B细胞线性抗原表位图谱；继而用A/H1N1疫苗接种志愿者血清和已鉴定含表位最小基序8肽融合蛋白，筛选鉴定表位中抗体中和性或保护性表位；同时通过同源蛋白序列比较，发现所鉴定全部表位中100％或高保守性的B细胞线性抗原表位（其余确定为型特异性表位）。前者保守性表位可今后用于研发"通用"预防性多表位肽流感疫苗，后者可用于研制临床诊断用特异性多表位肽表位抗原。本项目是第一次创新性地对流感病毒三个靶蛋白进行抗原表位组学研究。

本项目用课题组先前自主建立的专门用于抗原表位作图的改良生物合成肽法，结合制备的兔抗重组2009-A/H1N1流感病毒株编码血凝素HA和基质蛋白M2抗血清，通过第一轮分别覆盖它们各自全长序列相互重叠9个残基的系列18聚抗原性肽，和第二轮对覆盖全部反应性18聚肽的相互重叠7个残基的系列8聚肽的抗体结合最小基序肽的精细鉴定，解码了分别由20和4个表位构成的两个靶蛋白的非构象型抗体表位组。另外，通过对甲型流感病毒Group 1和Group 2中代表性亚型株以及A/H1N1突变株的基于各表位最小基序靶蛋白序列比对，确定了所有发现表位在同源蛋白中的保守性和特异性，特别是其中的广谱性表位。作为重要的研究结果，一是第一次绘制了流感病毒两个靶蛋白的完整精细表位组；二是在去跨膜区的基质蛋白M2上发现了四个几乎覆盖全部甲型流感病毒亚型的广谱性线性表位（ESMR70-73、QQSAVDV80-86、DDGH87-90和IELE94-97），另外，在HA蛋白上发现了6个在甲型流感病毒不同亚型或其突变株之间具有不同覆盖范围的广谱性抗原表位（LPFQNI307-312、LKSTQNAI382-389、ESMR70-73、QQSAVDV80-86、DDGH87-90和IELE94-97）。这些结果的获得具有重要科学意义，例如：1）两个靶蛋白IgG-表位组的解码为以后鉴定其中所有潜在的中和性/保护性抗体表位奠定了基础；2）若干广谱性线性表位的发现为未来研制‘通用’预防性甲型流感病毒疫苗的可行性首次提供了在线性表位水平的依据（以前是基于M2和HA2在同源蛋白之间的保守性以及近年来若干广谱交叉反应性的构象型抗体的发现）；3）M2和HA蛋白IgG表位组解码也为以后研制‘通用’预防性多表位肽流感病毒疫苗，包括研制用于A/H1N1感染后抗体检测的新型高特异性高灵敏度检测抗原，提供了更多候选广谱性和亚型特异性表位。