ChREBP基因启动子高甲基化与动脉粥样硬化

动脉粥样硬化（AS）与糖脂代谢紊乱、炎症、DNA甲基化密切相关。我们前期发现冠心病患者外周血白细胞碳水化合物反应元件结合蛋白（ChREBP）基因启动子高甲基化。本课题将进一步探讨其机制，为开发AS诊断新指标提供理论和实验依据。拟：1.流行病学调查冠心病患者白细胞ChREBP基因启动子高甲基化和炎症因子、代谢产物水平的关系；2.动态观察不同刺激物处理的单核细胞ChREBP基因启动子甲基化状态和细胞代谢指标的变化；3.分析ApoE-/-小鼠动物模型的AS斑块进程和白细胞ChREBP基因启动子甲基化程度的相关性。以上实验结果将证实ChREBP启动子高甲基化与AS的相关性是通过以下途径实现的：代谢产物和炎症因子刺激- - ChREBP基因启动子高甲基化低表达- - 单核细胞糖酵解受抑呼吸爆发- - 单核细胞分化和功能增强。

研究背景 越来越多的研究显示DNA甲基化与动脉粥样硬化性疾病相关。本项目组前期研究表明，碳水化合物反应元件结合蛋白（ChREBP）作为糖脂代谢和氧化还原信号通路的重要的转录因子，在白细胞中存在差异甲基化。本研究旨在人类和小鼠中探讨动脉粥样硬化疾病中外周血白细胞ChREBP基因DNA甲基化变化及其在疾病发生、发展中的机制。方法 采用重亚硫酸盐直接测序的方法检测了120例冠心病患者和96例对照外周血白细胞ChREBP基因甲基化阳性率；采用重亚硫酸盐结合克隆测序的方法检测了100例患者和100例对照以及40只ApoE-/-小鼠和20只对照小鼠的外周血白细胞ChREBP基因甲基化百分率。通过构建启动子不同片段的重组子，分析DNA甲基化对ChREBP基因启动子活性的影响。在随机抽取的41例患者外周血中分析了ChREBP基因mRNA水平。并收集了患者和对照的临床指标，采用常规方法检测了研究对象的血细胞分类计数和临床生物化学指标，运用高压液相色谱技术检测了研究对象的游离脂肪酸的水平。结果 直接测序的样本中，冠心病组ChREBP基因的甲基化阳性率显著高于对照组，对照组中甲基化阳性组的ALT水平显著高于未甲基化阴性组，而且患者血浆游离脂肪酸水平显著升高。而在克隆测序的样本中，ChREBP基因的去甲基化与HDL-C和ApoAI血浆浓度的降低有关，与ApoB血浆浓度和白细胞总数的升高有关，ChREBP基因的去甲基化与收缩压的升高有关；在动脉粥样硬化小鼠中，ChREBP基因的去甲基化与TG的升高有关，且无论在哪种饮食条件下，ChREBP基因的表达在正常小鼠肝脏中倾向于胞浆表达，而在ApoE-/-小鼠肝脏中呈现相反的情况。启动子活性分析显示启动活性最强的片段是包含CpG岛的片段之一，并且DNA甲基化会显著降低启动子活性。mRNA分析表明甲基化百分率和表达水平仅在甲基化百分率高于中位数的人群中呈负相关的趋势。结论 ChREBP基因的去甲基化通过上调基因的表达，与动脉粥样硬化疾病的风险因素如血浆TG、HDL-C、ApoAI、ApoB和白细胞数存在相关性。