小鼠转基因启动子甲基化与基因沉默关系的机制研究

目前在动物转基因研究中，外源基因表达框的结构和调控机制的相关研究还较少，在一定程度上制约了转基因动物的应用和发展。为了提高转基因动物外源基因的表达水平，本项目借助本课题组已经建立的小鼠原始生殖细胞（PGC）体外分离培养技术和转基因动物生产平台，利用DNA甲基化检测技术来分析转基因启动子的DNA甲基化与目的基因表达沉默之间的关系，阐明在转基因动物体内外源基因启动子甲基化对目的基因失活的确切影响，探讨启动子甲基化影响目的基因表达的分子机制，为今后转基因动物的有关研究和应用提供理论依据，从而使转基因动物在各个领域发挥其更大的作用。

近年来，转基因过程中外源基因的沉默现象严重制约着转基因动物的发展和应用。许多因素都可导致转入的外源基因沉默，如整合位点、拷贝数、表观遗传修饰等。研究报道显示，在哺乳动物中，DNA甲基化对基因表达的调控具有重要意义，且可能是导致基因沉默的主要因素。目前在动物转基因研究中，外源基因表达框的结构和调控机制的相关研究还较少，在一定程度上也制约了转基因动物的应用和发展。为了提高转基因动物外源基因的表达水平，我们利用甲基化分析技术，定量PCR技术以及蛋白印迹技术研究了转基因启动子的DNA甲基化与目的基因表达沉默之间的关系，阐明在转基因动物体内外源基因启动子甲基化对目的基因失活的确切影响；通过构建了脂肪特异性甲基化敏感型启动子表达载体，探讨启动子甲基化影响目的基因表达的分子机制，为今后转基因动物的有关研究和应用提供理论依据，从而使转基因动物在各个领域发挥其更大的作用。我们的研究结果表明：Leptin和PPARγ2基因的启动子甲基化比例与mRNA的表达量呈显著负相关，表明其表达受启动子甲基化调控的作用显著。通过构建Leptin和PPARγ2基因的启动子驱动EGFP表达的质粒载体，并转染前脂肪细胞，转染结果显示pLeptin-P-EGFP和pPPARγ2-P-EGFP特异表达于诱导后的成熟脂肪细胞；探讨了同一窝的CAG-GFP纯合转基因小鼠荧光强度不同的原因，揭示了Dnmt3b介导的CAG启动子甲基化可抑制外源基因的表达，并导致在同一窝后代中的纯合转基因小鼠的外源基因表达不稳定。