Zic1基因启动子高甲基化及其胃癌抑制作用的分子机制研究

启动子甲基化异常导致抑癌基因失活是肿瘤发生的重要机制之一。我们前期发现胃癌细胞zic1基因表达下调与启动子高甲基化有关，zic1有抑制胃癌细胞增殖功能。课题拟深入研究胃癌细胞中zic1基因启动子甲基化与组蛋白修饰（H3K9和H3K27甲基化）的染色质修饰改变，明确zic1基因表达"沉默"或失活的表观遗传分子机制；检测正常胃组织－胃癌前病变（萎缩性胃炎、肠化、不典型增生）－胃癌不同病理阶段zic1基因的甲基化改变，研究zic1甲基化测定对胃癌高危人群筛选和监测的价值；建立zic1过表达胃癌细胞株，利用cDNA microarray筛选zic1调控的重要胃癌相关基因及其信号通路关键靶基因，并研究zic1转染胃癌细胞后对细胞周期和凋亡的关键分子调控途径。明确新发现胃癌抑癌基因zic1染色质分子修饰及其对胃癌细胞抑制作用的分子机制，将有望筛选到胃癌表观遗传生物标记物和表观遗传通路上的潜在分子靶点。

背景和目的： 我们前期采用cDNA微阵列分析和启动子甲基化检测发现ZIC1基因在胃癌细胞中沉默表达或显著表达显著下调，这种低表达现象与启动子高甲基化相关。本课题探讨ZIC1在胃肠癌中的表达情况及其DNA启动子甲基化状态，进一步研究ZIC1对胃癌细胞生物学行为的影响及其对关键信号通路的调控机制，并筛选ZIC1调控的可能下游靶基因。.方法：用甲基化特异性PCR(MSP)检测37例胃癌、40例结肠癌及癌旁正常组织的ZIC1 基因启动子区DNA甲基化情况。Transwell试验检测ZIC1对胃癌细胞生物学行为（细胞增殖、迁移及侵袭）的影响。采用流式细胞仪分析过表达ZIC1后胃癌细胞周期和细胞凋亡的变化，采用Western blot检测细胞周期相关蛋白(p21, p27, cyclinD1)和细胞增殖MAPK、PI3K信号通路关键蛋白(Akt, Erk1/2)的变化。通过建立外源性过表达ZIC1胃癌细胞株，探讨其对Shh蛋白表达的影响；进一步利用Cyclopamine阻断Shh信号通路，研究对细胞周期关键蛋白(p21, cyclinD1)的表达及其对胃癌细胞迁移的影响。利用基因表达谱芯片技术检测筛选ZIC1可能的下游调控基因，并对其中差异表达基因进行Q-PCR验证。.结果：ZIC1在7株胃癌细胞、6株结肠癌细胞中沉默表达或显著表达下降。经过5-aza去甲基化药物处理后，其中5个胃癌细胞株、3个结肠癌细胞株恢复表达ZIC1基因。MSP检测发现胃癌（94.6%，35/37）、结肠癌组织（85%，34/40）发生ZIC1启动子高频率甲基化，而癌旁正常组织没有发生甲基化。过表达ZIC1抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。过表达ZIC1显著抑制Akt、Erk1/2磷酸化水平，进一步调控了细胞周期相关蛋白p21,p27 和cyclin D1的表达，从而调控胃癌细胞周期G1/S 检测点。通路抑制剂阻断Shh下游分子可以影响胃癌细胞p21和cyclinD1表达，并抑制细胞迁移。ZIC1可能通过调控胃癌细胞周期、增殖、迁移和转录调控等相关下游功能基因，从而发挥重要生物学功能。.结论：ZIC1在胃癌、结肠癌细胞的沉默表达或者低表达，并与DNA启动子的高甲基化有关。ZIC1可能通过抑制PI3K 、MAPK和Shh信号通路及其下游分子，从而抑制胃癌的发生发展。