构建GPV感染性克隆探索鹅胚化弱毒株毒力减弱的分子机制

鹅细小病毒强毒株在鹅胚上连续传代可以使毒力减弱而能够作为疫苗株使用，但致弱的分子机制一直尚未阐明。在前期的预研究中，我们已成功构建了含有GPV弱毒疫苗株 SYG61-41全基因组的感染性克隆pSYG61，通过转染293细胞或直接转染11日龄鹅胚均能有效的拯救出感染性病毒子。在此基础上，拟进一步构建含有强毒株LY03全基因组的感染性克隆pLY03。在对强弱毒株全基因组序列充分比较基础上，分析可能对毒力产生影响的差异DNA片段，通过选择合适酶切位点，在质粒之间交换差异片段，应用已建立的有效转染方法对改造后的重组质粒进行转染拯救，并通过鹅胚扩毒、用易感雏鹅攻毒的试验方法对拯救病毒的毒力进行评估。在确定出与毒力减弱相关DNA片段基础上，对关键的氨基酸位点或碱基予以定点突变，并验证这些突变位点对GPV毒力变化带来的影响。GPV毒力致弱机制的阐明对于进一步深入研究GPV的致病机理具有指引作用。

SYG61v是鹅胚传代致弱的GPV疫苗株，该课题的研究目标是以构建GPV强弱毒株的感染性质粒克隆为基础，通过差异片段交换和定点突变方法，探索对SYG61v株毒力减弱起决定性影响的关键蛋白、氨基酸位点或碱基。.我们先后测定了SYG61v疫苗株和LH、YZ99-6强毒株的全基因组序列。对SYG61v与5个分离于不同年代的GPV强毒株，在编码蛋白氨基酸序列及非编码调控区序列进行了比对。在VP1和Rep1蛋白，SYG61v分别产生了11个和10个氨基酸突变。Rep1的7个突变位点均处于Rep蛋白羧基端的100个氨基酸范围内。VP1蛋白的突变氨基酸位点分别为N49S，Q116R，P143S，V144I，A149V，S178T，N265T，F476L，H637Y，T672S，V718I，其中4个氨基酸突变处于VP1蛋白N端独特区，2个氨基酸突变存在于VP2蛋白氨基端，在VP3蛋白中存在5个突变位点。在这些突变氨基酸中，仅有1个位点（F476L）处于病毒衣壳外表面。在左侧ITR与P9启动子之间非编码区，存在两处共7个碱基的连续碱基突变。以SYG61v疫苗株和强毒株LH 为代表，分别构建了含有其全基因组的质粒pSYG和pLH，并建立了通过绒毛尿囊膜途径转染质粒拯救感染性病毒的高效方法，通过在拯救病毒中引入点突变以区分于亲本病毒，研究表明拯救病毒与其亲本病毒具有相似的生物学特性。.以pSYG和pLH质粒为基础，通过重叠PCR方法，在pSYG和pLH质粒之间互换Rep1和VP1基因片段，获得了嵌合病毒。雏鹅攻毒试验表明，携带强毒株VP1基因的pSYG-vRC、pSYG-vVP1和pLH-aRep1三个嵌合病毒对雏鹅表现出明显致病性，死亡率在75%~87.5%之间。完全携带弱毒株rep-cap编码框的pLH-aRC病毒攻毒组雏鹅无一死亡。携带强毒株Rep1基因的pLH-aVP1和pSYG-vRep1病毒攻毒组雏鹅无一死亡，但在试验期内部分雏鹅生长迟缓。嵌合病毒攻毒试验结果表明结构蛋白VP1基因的氨基酸点突变对SYG61v株的毒力减弱起着关键作用，而Rep蛋白点突变对毒力的转变也发挥有影响，但它的重要程度与VP1 蛋白相比明显处于次要地位。