氮氧阴离子转运蛋白跨膜转运底物的分子机理的结构生物学研究

膜蛋白在跨膜物质运输、能量传递、信号传导、细胞识别与免疫等过程中均发挥重要作用。其结构生物学研究可阐明相关分子机制，还可为针对膜蛋白的药物开发等应用研究提供结构依据，目前已成为国际上结构生物学领域最为活跃的研究热点之一。膜蛋白的晶体结构研究一直是结构生物学领域公认的高难度课题。氮氧阴离子转运蛋白家族就属于这类蛋白。已知该家族蛋白可转运氮氧阴离子（硝酸根、亚硝酸根离子）进出细胞膜，调控细胞氮源营养的摄入、外排以及胞内氮素水平，对植物、真菌和细菌的生长很关键；还通过对细胞氮源摄入和脱氮的调控参与生物圈氮循环。该家族蛋白如何跨膜转运底物目前有多种推测的模型，但准确分子机理尚不清楚，亦无任何三维结构被报道。我们计划解析这一本体膜蛋白的晶体结构，在此基础上阐明其转运及调控的分子机理。目前该课题我们已取得重要的进展：获得了可衍射的膜蛋白晶体，晶体质量尚在优化之中。

膜蛋白在跨膜物质运输、能量传递、信号传导、细胞识别与免疫等过程中均发挥重要作用。其结构生物学研究可阐明相关分子机制，还可为针对膜蛋白的药物开发等应用研究提供结构依据，目前已成为国际上结构生物学领域最为活跃的研究热点之一。膜蛋白的晶体结构研究一直是结构生物学领域公认的高难度课题。我们的研究对象——氮氧阴离子（NO3-/NO2-）转运蛋白——就属于这类蛋白。该蛋白可转运氮氧阴离子进出细胞膜，调控细胞氮源营养的摄入、外排以及胞内氮素水平；广泛参与植物、真菌和细菌等多种生物体的细胞生长，调控植物根和芽的发育分化，调节人的全身性NO3-/NO2-/NO平衡；还与沙门氏菌引发的伤寒症密切相关。此前，该蛋白如何跨膜转运底物有多种推测的模型，但准确分子机理尚不清楚，亦无三维结构被报道。.我们解析了NNP亚家族氮氧阴离子转运蛋白NarU的晶体结构，捕捉到了多种功能态构象；结合系统的生化和功能研究，我们首次准确地测定了转运蛋白与底物NO3-及NO2-的结合亲和力，确证蛋白可选择性结合、转运NO3-/NO2-，有显著的底物选择性；并成功地鉴定出该家族转运蛋白的底物结合位点、转运通路，确证了其中参与调控的关键氨基酸；揭示了该亚家族转运蛋白显有别于MFS超家族其他成员的独特序列特征的三维结构本质，并基于此提出了NNP亚家族转运蛋白底物的新模型，该模型明显有别于MFS超家族其他成员所通用的、经典的Rocker-Switch Model。成果得到国际著名学术期刊《德国应用化学》的亮点述评推介。此外，我们还解析了FNT家族NO2-转运通道蛋白NirC在酸、碱、及中性pH条件下的三个高分辨率晶体结构。结构分析揭示该家族蛋白在进化上应该是由2个三次跨膜螺旋结构域的Internal Repeat而形成的功能性底物转运通道；功能研究证实了它对较小的单价阴离子底物的良好选择通透性，并确证了蛋白对NO2-的通透是H+偶联的同向运送过程，进而揭示其阴离子选择性及对NO2-的优势通透性的结构基础和分子机理。