酶法合成糖苷类化合物

用基因工程技术从嗜热古细菌中克隆、表达嗜热糖苷酶，并用定点突变、定向进化、DNA重组等分子生物学方法和现代酶工程技术对酶进行修饰，制备能够耐有机溶剂、高效率地催化苦杏仁苷等糖苷类天然产物合成的糖苷酶，将为糖苷类天然产物的合成及中药现代化提供高活性高稳定性的新酶源和酶催化仲醇糖苷化的新途径。用固态核磁共振等生物物理学方法研究有机溶剂对酶结构和催化活性的影响规律，探讨这种影响产生的机理，在此基础上建立适用于糖苷酶催化糖苷类天然产物合成的反应体系，实验结果有可能为今后酶催化有机合成的研究与应用提供某些新的启示，减少当前该领域研究中所存在的盲目性和随机性。合成具有双亲性质的固定化载体，并用其制备固定化酶，或采取酶与底物共固定的策略，使酶与底物充分接触，提高酶的催化效率，为提高有机介质中酶的催化效率提供一种新的思路和新的实验方法。

糖苷酶称为糖基水解酶，是一类水解O-、N-和S-连接糖苷键的酶。糖苷酶来源广泛，既存于植物与动物中，也存在于微生物中。酶法合成糖苷化合物的研究日趋成熟，到目前为止，利用糖苷酶合成糖苷化合物的种类也非常丰富，如寡糖、脂肪醇和芳香醇的糖基化，也有酚类，生物碱及多肽的糖基化等。随着一些新型嗜热糖苷酶出现，嗜热糖苷酶在酶法合成糖苷化合物方面的应用也逐渐增多如功能性低聚糖和烷基糖苷。功能性低聚糖是一种益生元，它们不能够被人体内的酶所分解，从而被肠道 内的乳酸菌和双歧杆菌所利用，促进肠道健康，现已广泛用于日本和西方等发达国家的食品当中。烷基糖苷是一种新型非离子表面活性剂，刺激性小，且可生物降解，在医药、食品及化妆品等领域都有较高的应用价值。烷基糖苷常用葡萄糖为原料，所用醇的碳链长度一般为8-18。. 本项目从嗜热细菌Thermotoga naphthophila RUK10中获得两个嗜热糖苷酶基因，β-半乳糖苷酶Tnap1577和β-葡萄糖苷酶Tnap0602，将两个基因分别转入大肠杆菌中进行外源表达，进行了基本酶学性质的表征。β-葡萄糖苷酶Tnap0602催化oNPG等显色底物的最适反应温度为95度，催化多糖类水解的温度为85度，相对应的最适pH为7.0和5.5。在75度、80度、85度和90度的半衰期为84小时、32小时14小时和3小时，β-葡萄糖苷酶Tnap0602用于功能性低聚糖的合成取得了较好的催化效果。β-半乳糖苷酶Tnap1577的最适反应温度与底物也相关分别为90度和70度，半衰期在不同温度下差别也比较大，在75度为10.5小时，在90度为0.3小时。。Tnap1577在烷基糖苷的合成反应中可催化丁基、己基和辛基糖苷的合成，在整个反应中酶活力保持很高。后续工作将以嗜热糖苷酶的结构为基础，通过蛋白质工程手段对酶进行基于合成反应的改造和设计，使其更适合于天然底物。. 本项目共培养硕士生5人，博士生2人，其中3人在读。共发表文章10篇，其中SCI8篇，另外待发表论文2篇。