肿瘤特异性启动子调控的MRI成像特异诊断恶性肿瘤的实验研究

The evaluation of malignant behaviour of tumor determines the selection of treatment.Up to date, it is difficult to evaluate the malignant behaviour of tumor for imaging diagnosis. In the project,the Ferritin-gene vector mediated by hTERT promoter will be constructed. The vector will be transfected to benign and malignant tumor cells in vitro and be intravenously injected into rats with benign and malignant tumors in vivo. The tumor cells in vitro and tumors in vivo will be detected by MRI at different time point.The MRI signal changes will be analyzed. For the tumor cells in vitro and tumor tissue,the RT-PCR,WesternBlot,immunohistochemical staining and Prussian blue staining will be performed to test the expression of Ferritin gene.The ferritin expression will be compared with the MRI signal changes. hTERT promoter is the specific promoter of malignant tumor and will be mediated the expression of ferritin gene only in malignant tumor cells, not in normal cells and benign tumor cells,which will form the endogeneous MRI contrast agents.So, the MRI signal change will reflect the malignant behaviour of tumors. The research design is different from that of targeted imaging.

肿瘤良恶性的判断直接影响治疗方案的选择，目前影像学检查对部分病变的良恶性鉴别仍然存在困难。本项目拟构建hTERT启动子启动的铁蛋白基因载体，从体外（将该载体转染于良恶性肿瘤细胞）和活体（静脉注射该载体于良恶性肿瘤动物模型）两方面进行研究。采用MRI扫描于不同时间点观察体外细胞、活体肿瘤的信号变化，并对活体肿瘤信号变化区、体外细胞行RT-RCR、Western Blot、免疫组化、普鲁氏蓝染色以检测铁蛋白表达情况，对照MR信号改变特特点与组织病理检查结果。由于hTERT启动子是恶性肿瘤特异性启动子，只能在恶性肿瘤细胞内启动铁蛋白基因的表达并形成内源性的MRI对比剂，而在正常细胞及良性病变细胞处于关闭状态，不能形成对比剂，因此MRI一旦探测到信号变化即可反映肿瘤的恶性生物学行为。本项目研究思路完全不同于目前的靶向影像学研究思路，并有望为良恶性肿瘤的鉴别诊断建立一种新的广谱MRI诊断方法。

癌症严重威胁着人类的健康和生命，恶性肿瘤的早期诊断和早期治疗非常重要。大量研究表明：人端粒酶逆转录酶（hTERT）的启动子可调控基因靶向性表达于端粒酶阳性细胞内，是目前已知最广谱的恶性肿瘤特异性启动子。此外，国内外许多研究证实：细胞内铁蛋白浓度增加，可使细胞摄取更多的铁离子，导致周围质子的横向弛豫率显著升高， MR信号发生变化，表明铁蛋白可作为报告基因用于MR成像。因此，我们设想构建由hTERT启动子调控Fth报告基因过表达的慢病毒载体，进行体内外实验，探索该报告基因系统诊断恶性肿瘤的可行性。首先，构建由人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控铁蛋白重链（Fth）报告基因表达的慢病毒载体Lenti-hTERT-Fth1-3FLAG-Puro，同时构建由CMV启动子调控的慢病毒载体作为对照。将慢病毒载体用于转染3株端粒酶阳性细胞和2株端粒酶阴性细胞，进行免疫荧光染色和酶联免疫吸附实验（ELISA）检查细胞Fth表达情况，应用总铁检测试剂盒和普鲁士蓝铁染色检测细胞聚铁能力，行MR扫描检测细胞信号变化。最后，建立移植瘤，瘤内注射慢病毒载体后进行MR扫描检测肿瘤信号改变，并通过免疫荧光染色检测细胞内Fth蛋白表达情况以及普鲁士蓝铁染色检测肿瘤内聚铁情况。实验结果表明，当转染慢病毒Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro载体后，只有端粒酶阳性细胞（A549、SKOV3和293T）过表达Fth-flag蛋白，并摄取大量的铁离子储存于细胞内，导致细胞的T2*WI信号明显降低，R2*值显著升高；而端粒酶阴性细胞（U2OS和HPDLF）内未见有Fth-flag蛋白表达，细胞摄铁能力亦未见增强，MR信号亦未发生显著变化；当瘤内转染转染慢病毒Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro载体后，只有端粒酶阳性肿瘤（A549）的T2*WI信号明显降低，免疫荧光染色亦证实肿瘤过表达Fth-flag蛋白并聚集大量的铁离子；而端粒酶阴性肿瘤（U2OS）内未见有Fth-flag蛋白表达，肿瘤内未见聚集有大量铁离子。该实验研究表明，利用hTERT启动子对端粒酶的靶向作用，可实现应用MR铁蛋白报告基因成像技术特异性检测恶性肿瘤，该研究亦为活体广谱诊断恶性肿瘤提供了一种新思维和新方法。