细胞巨型胞饮调控因子的高通量筛选及功能研究

Macropinocytosis is a clathrin-independent endocytic route that mediates the nonselective uptake of extracellular nutrients and fluid. Although many of the players such as small GTPases, cytoskeletal proteins and inositol phospholipids have been identified, how they coordinate to facilitate efficient macropinocytosis under different environmental conditions is poorly understood. It has been shown that RAS-transformed cells internalize extracellular proteins through macropinocytosis to support their proliferation. Utilizing the growth advantage displayed by cells with upregulated macropinocytosis under free amino acid deprived conditions, we will carry out a CRISPR/Cas9-based high-throughput screening to identify novel regulators of macropinocytosis. We will also examine the involvement of RasGAP domain-containing proteins in this process. Our research will not only advance our understanding of macropinocytosis, but also provide new insights in cell endocytosis and membrane dynamics in general.

巨型胞饮是一类重要的网格蛋白非依赖的胞吞途径，可以非选择性内吞细胞外营养物质和液相大分子。细胞巨型胞饮过程受很多因素调节，如小G蛋白、细胞骨架和肌醇磷脂等，但它们在不同环境下如何调控巨型胞饮的机制仍不清楚。前期研究发现RAS转化的肿瘤细胞可以通过巨型胞饮内化外源蛋白，以支持细胞增殖。以此为基础，本项目选用HeLa细胞为实验材料，一方面通过CRISPR/Cas9技术结合特定sgRNA库，借助巨型胞饮增强的细胞在无氨基酸培养条件下的生长优势进行高通量筛选，寻找巨型胞饮的调控因子；另一方面通过对包含RasGAP domain蛋白的筛选，研究候选基因对细胞巨型胞饮能力的调控及作用机制。本项目的研究不仅能帮助我们进一步阐明巨型胞饮内吞途径的分子生物学机制，也能丰富我们对细胞内吞作用和生物膜系统动态变化的认识。

巨型胞饮是一类重要的网格蛋白非依赖的胞吞途径，可以非选择性内吞细胞外营养物质和液相大分子。细胞巨型胞饮过程受很多因素调节，如小G蛋白、细胞骨架和肌醇磷脂等，但它们在不同环境下如何调控巨型胞饮的机制仍不清楚。前期研究发现RAS转化的肿瘤细胞可以通过巨型胞饮内化外源蛋白，以支持细胞增殖。以此为基础，本项目选用HeLa细胞为实验材料，通过CRISPR/Cas9技术结合特定sgRNA库，一方面借助巨型胞饮增强的细胞在无氨基酸培养条件下的生长优势进行高通量筛选，另一方面利用荧光标记的70kDa dextran表征巨胞饮能力，借助流式分选技术分选不同荧光强度的细胞群，然后通过基因测序寻找巨型胞饮的调控因子。我们鉴定出Myosin VI与巨型胞饮之间的调控关系。Myosin VI是唯一一类可延微丝蛋白，并向其负极运动的分子马达，较多的研究发现其与clathrin-assosiated endocytosis相关，而我们的研究发现Myosin VI敲低或敲除都可以显著抑制细胞巨型胞饮能力。Myosin VI可能通过影响F-actin等细胞骨架的动态变化，减少褶皱的产生，从而影响巨型胞饮泡的初始形成阶段，引起细胞巨型胞饮能力的降低。同时还发现Myosin VI敲低或敲除都可以调节Rab5的亚细胞定位，即集中在细胞核周围，并且这些Rab5-positive囊泡同时也是Rab7/EEA1-positive的，表明它们可能已经提前进入晚期endosome阶段。本项目的研究不仅能帮助我们进一步阐明巨型胞饮内吞途径的分子生物学机制，也能丰富我们对细胞内吞作用和生物膜系统动态变化的认识。