原发性开角型青光眼家系致病基因的定位与鉴定研究

原发性开角型青光眼（primary open angle glaucoma, POAG）是一类引起不可逆盲的重要眼病，遗传因素与其发病密切相关。本项目拟在前期工作的基础上，首先增加POAG家系和散发病例样本量，通过STR分型判断新家系或病例是否存在新的POAG位点；其次通过SNP芯片全基因组扫描具有新位点的家系并连锁分析，找出新的致病基因∕位点所在染色体位置；同时对已知连锁区域2p15-p16.3的家系进行高密度STRs和tagSNPs扫描和连锁分析，进一步缩小致病基因连锁的最小遗传间距；然后利用候选基因法筛选最小区域内最有可能的候选基因，测序鉴定与家系患者共分离的突变位点；最后根据致病基因在人体内分布和表达差异，进行初步体外功能研究，从而定位并初步鉴定重庆地区POAG家系的致病基因，为阐明POAG分子遗传学机制及其早期诊断和治疗提供重要线索。

本项目在前期工作的基础上，陆续收集重庆地区POAG大小家系共计16个，其中4代以上大型POAG家系2个，提取家系样本基因组DNA共计258例，在原有连锁区域2p15-16.3的基础上，通过加密STR精细定位，将连锁区域定位于D2S391至D2S2231一段长约14cM的染色体区域内，然后通过全基因组外显子测序，进一步将连锁区域缩小至rs46411503至rs65629132的范围内，再通过PPI等生物信息学方法确定了MSH6，MSH2，REL，EPAS1，VRK2，FBXO11，EFEMP1，RTN4，RAB1A，ACTR2，CALM2和CD2共12个候选基因.其中，VRK2和FBXO11通过与p53蛋白相互作用来调控线粒体膜的渗透及组构，MSH2负责DNA错配的修复，RTN4参与神经元的再生，CALM2还在神经节细胞的凋亡及细胞通讯的氧化损伤过程中发挥着重要作用，CD2基因由于在PPI网络分析中与多个POAG相关基因相互作用，并在GO和KEGG分析中频繁出现，我们推测CD2基因的突变很有可能与青光眼的发生相关。为此，我们进行了CD2基因与HSP在培养人小梁细胞中互作关系的研究：首先将正常眼小梁细胞与POAG眼小梁细胞的CD2基因钓取进行序列比对，发现青光眼CD2基因在596位与666位发生突变，然后将CD2基因在E.coli中进行异源表达，再选择HSP27作为检测标记，将构建得到pCD2-1与pCD2-2质粒转染到正常眼小梁细胞中进行培养，然后从转录水平和蛋白水平分别检测突变后的CD2基因是否影响HSP27的表达，结果发现突变的CD2导致HSP27过量表达，说明CD2基因的突变可能导致POAG的发生。