肽基脯氨酰异构酶1在2型糖尿病下肢动脉再狭窄中的作用及机理研究

Endovascular intervention has emerged in recent years and is considered as one of the most significant treatment for lower extremity atherosclerotic occlusive disease. How to reduce the restenosis rate is a medical research focus today. Of note, the risk of restenosis is particularly high in patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM). However, the underlying molecular mechanism is unclear. Recently, we found that intima restenosis was inhibited by appling sustained-release system with Pin1 inhibitor juglone to the exposed adventitial surface of the femoral artery right after guidewire injury. In addition, the apoptosis rate of primary rat femoral artery smooth muscle cells (VSMC) cultured in T2DM rat serum was markedly inhibited, accompanied by upregulation of Pin1 level. These previous research suggest that Pin1 may play a key role in T2DM restenosis after endovascular treatment. On the basis of these significant studies, we try to observe the VSMC proliferation, apoptosis and migration changes by lentivirus mediated overexpression or knockdown of Pin1. Furthermore, the role of Pin1 in arterial restenosis in T2DM rats was elucidated by topical application of lentivirus mediated shPin1 or juglone in vivo experiments, and through PPIase activity assay, co-immunoprecipitation and immunoblotting et al, the possible signaling pathway involved in these process was also explored. This research was designed to shed light on the molecular mechanisms of Pin1 in restenosis with T2DM and provide valuable clues for preventing or treating restenosis in cinical practice.

血管腔内治疗术是目前临床上治疗下肢动脉硬化闭塞症的重要方法。如何降低术后再狭窄率是当今医学研究的热点。值得注意的是，2型糖尿病（T2DM）患者术后再狭窄的机率明显增高，但其机制还不清楚。最近我们通过凝胶缓释系统将肽基脯氨酰异构酶1(Pin1)抑制剂胡桃醌作用于T2DM大鼠股动脉损伤段的外膜，发现内膜增殖受抑制。另外，通过培养原代大鼠股动脉平滑肌细胞（VSMC），发现T2DM大鼠血清可明显抑制细胞凋亡，同时伴随Pin1上调。揭示Pin1可能是造成T2DM术后再狭窄的靶基因。本课题拟以慢病毒作载体，过表达或敲减VSMC内Pin1，观察细胞增值、凋亡和迁移变化，通过局部应用载shPin1慢病毒或胡桃醌在体内实验进一步阐明Pin1在T2DM再狭窄中的作用，并通过PPIase活性检测，免疫共沉淀，免疫印记等技术探讨其可能涉及的信号传导途径。该研究将为T2DM再狭窄的机制研究及防治提供有价值的线索。

2型糖尿病（T2D）与血管成形术（包括开放手术和微创介入术）之后增高的再狭窄率直接相关。我们先前已经证明了Pin1在血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖和凋亡中发挥了重要的作用。但是Pin1在T2D再狭窄的作用，以及Pin1在这些过程中的分子机制尚未被阐明。由高脂饮食（HFD）和STZ菌素注射建立T2D小鼠模型。免疫组化染色和Western blot检测显示，在T2D小鼠股动脉组织和模拟T2D培养条件下VSMCs的Pin1表达均上调。其次，T2D小鼠股动脉导丝损伤后，我们观察到，动脉新生内膜增生组织的Pin1的活性增加。进一步的研究证实，10％T2D小鼠血清或Pin1过表达均可刺激VSMCs增殖，抑制凋亡，加速细胞周期进程和VSMCs的迁移，而Pin1敲减后，均出现相反的结果。我们证明了STAT3信号和线粒体依赖途径在Pin1在 T2D环境下调控细胞周期和细胞凋亡的过程中发挥了重要作用。此外，Pin1通过激活血管内皮生长因子的表达，从而在T2D环境下调节VSMCs的迁移。最后，通过PLURONIC F127凝胶和Pin1抑制剂胡桃醌混合物，涂抹至导丝损伤的股总动脉外膜，可显著抑制内膜/外膜比值。我们的研究结果证明在T2D环境下，Pin1对VSMCs增殖，细胞周期，细胞凋亡和迁移，以及新生内膜形成均有重要作用。因此 Pin1可作为一个潜在的治疗靶点，以防止T2D动脉再狭窄。. 另外，我们建立了体内使用Pin1小干扰RNA抑制动脉内膜增生的方法。实验旨在确定通过PLURONIC F127（PF127）混合慢病毒介导的siPin1局部用药是否能抑制新生内膜的形成，并进一步探讨其可能的机制。体外实验研究表明，稀释在PF127的慢病毒介导的siPin1能抑制VSMCs增殖并诱导VSMCs衰老。此外，siPin1导致VSMCs中磷酸化Akt表达水平下降。 Akt磷酸化再激活克服了siPin1介导的衰老。在大鼠导丝股动脉损伤模型中，损伤后14天，股动脉外膜涂抹由PF127和慢病毒介导siPin1混合物能产生抑制内膜增生的作用，而无药物毒性证据。此外，新生内膜厚度的降低与PCNA阳性细胞的减少的和降低的端粒酶活性正相关。因此，这些结果表明，PF127作为缓缓释剂，将慢病毒介导的siPin1外涂到损伤动脉可具有治疗再狭窄的潜在作用。