异色菊DdICE1转录因子克隆及其抗寒调控机制

菊花是我国十大传统名花和世界四大切花之一，观赏和经济价值极高。低温是限制菊花周年生产供应的主要限制因子。植物抗寒性为多基因控制的数量性状，常规育种周期长、效果差。因此，高效抗寒调控基因的发掘是菊花抗寒育种的关键。本研究以原产我国的优异抗寒种质异色菊为材料，采用兼并引物结合3'-RACE、5'-RACE技术克隆高效抗寒调控转录因子DdICE1，并开展该基因的组织表达特性、亚细胞定位研究；采用TAIL-PCR技术和衔接头PCR法克隆其启动子调控区，进行启动子调控区顺式调控元件分析及DdICE1基因受不同胁迫调控表达的特性研究；采用凝胶阻滞实验研究DdICE1与DdCBF3/DREB1A启动子区的E-BOX结合活性，并通过酵母单杂交技术探讨其转录激活活性。项目研究不仅可获得高效抗寒调控基因DdICE1及揭示该基因响应胁迫的调控表达特性，还能丰富植物耐寒分子机理，为推进菊花抗寒分子育种奠定基础。

低温是限制菊花周年供应的主要限制因子，培育抗寒菊花新品种显得至关重要。挖掘菊属植物中优异的抗寒基因并探索其机制，对栽培菊花的抗寒育种及应用具有前瞻价值。前期研究表明，菊花DREB家族基因在冷驯化调控植物抗寒路径中发挥关键作用，然而DREB基因上游调控机制仍不清楚。由此，本研究以抗寒异色菊为材料，分离到一个DREB基因上游的ICE家族同源基因CdICE1，编码471个氨基酸，序列分析与其他物种ICEs具有高度相似性。通过荧光定量表达分析发现，低温、盐和ABA均诱导了CdICE1基因的表达；进一步采用TAIL-PCR和锚定PCR技术分离到CdICE1启动子，位于翻译起始位点上游1682 bp的区域，通过PLACE数据库比对分析发现了很多胁迫相关作用元件（GT1，MYB，MYC，W-BOX等元件）。构建35S::CdICE1-GFP表达载体，基因枪轰击洋葱表皮细胞进行瞬时表达，发现CdICE1定位于细胞核。采用毕赤酵母真核分泌表达系统，对CdICE1蛋白进行表达并纯化，凝胶阻滞（EMSA）试验证明CdICE1蛋白能与CdDREBa启动子中的MYC元件（CACATG）特异结合；酵母单杂交试验证明CdICE1具有转录激活活性。这些结果表明，异色菊中存在ICE1-DREB调节路径。为了进一步证明CdICE1的抗寒调控功能，将CdICE1基因转到拟南芥中，并进行抗冻表型分析和分子机制探索。结果发现，异源表达异色菊CdICE1基因显著提高了不同温度驯化下抗冻性。23-4ºC驯化下，CdICE1促进了CBFs及下游COR15a、COR6.6和RD29a三个抗冻基因的表达，与拟南芥AtICE1基因功能相似；而在23-16ºC驯化条件下，CdICE1介导了miR398-CSDs路径，提高抗冻性。培养研究生4名，发表SCI论文9篇；获授权国家发明专利3项；获得国家科技进步奖二等奖1项，江苏省科学技术奖一等奖1项；1项成果通过农业部鉴定。