低温响应转录因子PubHLH在梨抗寒中的功能及其调控机理

Freeze injury leads a gigantic economic losses to pear industry, cultivated the cold tolerance pear is imminent. So researching on the function of the cold responsive transcription factor PubHLH in cold tolerance of pear, mining the upstream and downstream protein of PubHLH, and revealing its regulation mechanism have important theoretical and practical significance. In preliminary studies, this project found a new PubHLH gene from Shan Pear, which is a cold tolerance variety, found that induced by low temperature, and proved that PubHLH could improve the cold-resistance of transgenic tobacco.On this basis, this project first constructs overexpression vectors and transforms them to Arabidopsis and Cui Guan Pear, constructs RNAi vector for PubHLH and transforms it to Shan Pear, and identifies the cold tolerance function of PubHLH, then uses digital expression profiling to analyze transgenic and non-transgenic Cui Guan Pear before and after low temperature treatment, and established the expression profiles. Next, the interacting protein of PubHLH was screened by two-hybrid system and verifid by BIFC. Then the full-length and lack of PubHLH gene promoter were identified by GUS staining activity, the next step is that using the cis-acting element of PubHLH gene promoter screen the yeast one hybrid library, the results will help us to get the upstream gene of PubHLH, and establish the model of stress response to low temperature network of PubHLH node. From the downstream and upstream gene of PubHLH regulated, we can found more new cold response genes that can be used in pear genetic engineering.

冻害对梨产业的发展造成极大的经济损失，培育梨抗寒新品种迫在眉睫，研究低温响应转录因子PubHLH在梨抗寒中的功能，挖掘其上下游互作蛋白，揭示其调控机理具有重要的理论和现实意义。在前期对抗寒山梨的研究中，发现了一个新的PubHLH基因，其受低温诱导，且在烟草中超表达该基因其抗寒能力明显提高。在此基础上，构建超表达载体转化拟南芥和翠冠，构建RNAi载体转化山梨，鉴定PubHLH抗寒功能，并对低温处理前后翠冠转基因和非转基因植株进行数字表达谱分析，建立差异基因表达谱；然后利用酵母双杂交筛选PubHLH的互作蛋白并验证；接着对已得到的PubHLH基因启动子全长及缺失进行GUS染色活性鉴定后，利用该基因启动子顺式作用元件筛选酵母单杂文库，得到其上游调控基因，从而建立以PubHLH为节点的低温胁迫应答网络模型。以期顺着PubHLH调控的上下游基因，找到更多的抗寒基因，为梨抗寒基因工程提供新的基因资源。

bHLH类转录因子参与植物一系列生理和生化过程。但是bHLH类转录因子能增强植物抗寒机理却未知。ICE1通过调控一系列逆境相关基因的转录来提高植物的抗寒。在这个研究中，我们从秋子梨克隆得到ICE1转录因子并对其抗寒功能进行了鉴定。PuICE1其表达模式表明其受低温，盐及干旱的诱导，特别是受低温的强烈诱导。PuICE1定位于细胞核，并能结合到PuDREBa的启动子顺式元件MYC上。转基因PuICE1番茄超表达分析表明，在低温处理下与对照植株相比，其抗寒性得以提高，表现在有较低的电导率，更高的脯氨酸含量，有较少的丙二醛含量，有更高的叶绿素含量，有更高的成活率及更高的酶活。酵母双杂，瞬时表达及Split荧光互补实验表明，PuICE1能够同PuHHP1互作。总之，上述结果表明PuICE1在抗寒中起一个正向调控的作用，其抗寒机理可能是PuICE1通过与膜蛋白PuHHP1的互作来共同调控下游一系列靶基因的表达，从而提高植物的抗寒。.在本研究中，我们从山梨中克隆了另一个bHLH转录因子,并且验证了其抗寒功能。PubHLH1受低温、盐、和脱水的诱导，但受低温的诱导最大。PubHLH1定位于细胞核。PubHLH1转基因烟草超表达赋予了其抗寒能力。低温处理后，与野生型(WT)相比，转基因株系有更高的成活率，有较高的叶绿素含量，有较高的脯氨酸含量，以及较低的电导率和较低的MDA含量。由于两个过表达株系含有对较少的ROS，在低温处理前后在烟草中对三个关键的抗氧化酶分别进行了测定。这些酶在转基因株系中的活性高于在正常条件下的野生型。经过低温处理后，转基因株中CAT和POD的活性明显增强，在WT上有轻微增加。但转基因株系这三个酶的活性比野生型增加更明显。为了进一步深入了解PubHLH1在植物抗寒上的分子机理。选取了8个逆境相关的基因在转基因植物上进行了表达模式分析，这8个逆境相关的基因在转基因烟草中的表达量比对照中稍微高一些。综上所述,这些结果表明，耐寒性转录因子PubHLH1发挥了关键作用，至少在某种程度上，导致了逆境应答基因的激活。