酶催化原位生成共反应试剂增强电致化学发光的超灵敏适体传感器研究

This project intends to construct the ultrasensitive electrochemiluminescence aptasensors based on in situ produced coreactants by enzymatic reaction, which could significantly enhance electrochemiluminescence efficiency and stability of the novel functionalized ruthenium complexes, for the trace determination of tumor and cardiovascular disease related serum markers (such as malignant tumor markers: SHP2, TNF; cardiovascular disease markers: VEGF, PPGF). The supramolecular hydrogel/different nanoparticles functionalized graphene or C60 nanocomposites with good biocompatibility, conductive ability and low background signal are used as the matrix of primary aptamer. Some nanocomposites, including metal nanoparticles functionalized graphene, carbon nanotubes and dendrimer polymer et al., are used as the carriers of secondary aptamer, enzyme and ruthenium complexes. With the double aptamer-based sandwich assay, the novel ultrasensitive electrochemiluminescence aptasensors could be constructed by the introducing of the in situ produced electrochemiluminescence coreactants (such as L-homocysteine, Penicilloyl salt etc.) by enzymatic reaction, which coexisted intra or inter of functionalized ruthenium complexes to significantly enhance electrochemiluminescence intensity and stability of the ruthenium complexes. In conclusion, this project will provide a new method for serological diagnoses with strong specificity, high sensitivity, low cost and fast detection, which effectively improves the efficiency of disease diagnosis.

本项目拟以肿瘤和心血管疾病相关的血清标志物为检测目标蛋白，利用酶催化原位生成能显著增强新型功能化钌配合物电致化学发光的高效及稳定的共反应试剂，构建超灵敏电致化学发光适体传感器实现疾病相关血清标志物（如恶性肿瘤标志物：SHP2、TNF；心血管疾病标志物：VEGF、PPGF）的痕量检测。以超分子水胶/纳米粒子功能化石墨烯或C60纳米复合材料构建生物兼容性好、传导能力强和背景信号低的适体Ⅰ固载基质，采用金属纳米粒子功能化石墨烯、碳纳米管和树枝状聚合物等复合纳米材料固载适体Ⅱ、酶及钌配合物，利用双适体夹心反应模式，结合酶催化原位生成与功能化钌配合物在同一分子内或分子间的共反应试剂（如L-高半胱氨酸、青霉噻唑等），显著增强钌配合物电致化学发光强度和稳定性，构建新型超灵敏电致化学发光适体传感器，旨在建立一种特异性强、灵敏度高、成本低廉及检测快速的血清学诊断疾病的新方法，提高疾病诊断效率。

恶性肿瘤、心血管疾病等是危害人类健康的严重疾病。研究表明，疾病的早期诊断和防御是治疗疾病的有效途径。近年来，随着临床检验医学的快速发展及一些疾病标志物（如： SHP2、TNF-β、cTnI、VEGF、PPGF等）的相继问世，相关疾病患者的早期诊断效率有所提高。目前对以上标志物蛋白的检测多采用酶联免疫法、放射免疫法和免疫比浊法等，酶联免疫法和免疫比浊法操作简单、易于普及，但存在假阳性高、灵敏度低等缺陷，限制了其在早期快速检测中的应用；放射免疫法虽然灵敏度高，但是需要涉及放射性物质，影响操作人员的身体健康。因此，研究快速、灵敏的方法实现相关标志物蛋白的检测对提高疾病早期诊断率具有重要的临床价值和社会效益。本项目以恶性肿瘤、心血管疾病等疾病相关的血清标志物作为检测目标蛋白，利用酶催化原位产生共反应试剂，缩短共反应试剂与电极表面的距离，显著提高电致化学发光效率，构建超灵敏电致化学发光生物传感器实现对疾病相关血清标志物蛋白的灵敏检测。以金纳米粒子功能化石墨烯或碳纳米管等纳米复合材料构建生物兼容性好、传导能力强和背景信号低的适体Ⅰ或抗体Ⅰ固载基质；采用比表面积大、生物兼容性高及催化能力强的金纳米笼、钯纳米笼及铂@金纳米花等纳米材料作固载适体Ⅱ、抗体Ⅱ、酶及发光试剂。利用双适体或双抗体夹心反应模式，结合酶催化及仿酶催化在电极表面原位产生共反应试剂（如脯氨酸、O2，H2O2等）或原位生成与发光试剂（钌配合物）在同一分子内的共反应试剂（如胺类基团），显著增强电致化学发光强度和稳定性，构建新型超灵敏电致化学发光生物传感器。例如，利用仿双酶原位产生共反应试剂构建的夹心型电致化学发光生物传感器可实现对心肌损伤标志物cTnI的灵敏检测，检出下限达到0.017 pg mL -1，为心肌损伤疾病的诊断及治疗提供了有效参考。另外，项目还基于酶催化原位产生共反应试剂的方法构建多种生物传感器实现了对多种其他疾病标志物（如AFP、TB及SS2等）的灵敏检测。本项目建立了一种特异性强、灵敏度高、成本低廉及检测快速的血清学诊断疾病的新方法，提高了疾病诊断效率。