基于外切酶链反应的超灵敏化学发光核酸检测研究

The disease diagnosis and related fundamental research require the determination of biomarkers at trace levels. Many methods based on the isothermal signal amplification have been developed to overcome limitation of target-to-signal ratio of 1:1 in the traditional assays, offering significant superiorities for the high sensitive and specific biomarker detection. Compared with signal amplification based on template replication using polymerase, the strategies of nuclease-assisted target recycling amplification exhibit less the risk of cross-contamination from amplicons and so false-positive results rarely occur. However, combined this technique with other signal amplification is required for the ultrasensitive detection of biomarker, since the current form of nuclease-assisted target recycling provides only linear amplification. This proposal is proposed to develop exponential signal amplification based on exonuclease-assisted target recycling (exonuclease chain reaction), and on basis of that, construct several ultrasensitive assays for model biomarker (hepatitis B virus surface-antigen gene, microRNA（let-7a）) using acridinium ester chemiluminescence and ATP bioluminescence as signal readout. These methods will be applied in multiplexed detection and in complex biological samples, which is beneficial for the rapid, ultrasensitive, specific and inexpensive detection of biomarkers in the clinical application and related fundamental research.

疾病的诊断、处理及相关基础研究越来越需要对生物标志物进行超灵敏检测。近年来建立起来的多种恒温信号放大技术，克服了传统生物分析中目标与探针1:1结合比的局限，改善了分析灵敏度。其中基于酶切目标循环的信号放大技术与依赖聚合酶进行模板复制的核酸扩增技术相比，避免了交叉污染，减少了非特异信号。然而，现有的酶切目标循环只能够实现信号的线性放大，需要与其它的放大技术联用，才能实现超灵敏检测。申请者拟发展基于外切酶的指数信号放大技术（外切酶链反应），采用吖啶酯化学发光以及ATP生物发光作为信号输出，以乙肝病毒DNA和microRNA（let-7a）作为模型分子，建立背景低、特异性强的超灵敏核酸检测新方法，探索该方法在多组分同时检测以及复杂生物样品中的应用，为临床及相关基础研究中生物标志物的快速、低成本、高特异超灵敏检测提供一种新方法。

本项目研究建立了基于外切酶、连接酶的超灵敏、高特异生物发光生物标志物检测方法，探索了该方法在多组分同时检测以及复杂生物样品中的应用，为临床及相关基础研究中生物标志物的快速、低成本、高特异、超灵敏检测提供了多种新方法。主要研究成果如下：.1.构建了嵌入RNA腺苷的DNA探针，用于生物发光实时监测外切酶III诱导目标循环信号放大，实现了血清样品中DNA目标物的灵敏特异检测；2.以microRNA自身所包含有的RNA作为生物发光信号分子，建立了无需转化和扩增的超灵敏生物发光microRNA检测方法，该方法具有低成本、简单、灵敏、快速等优点，并且通过磁分离去除干扰物质即可实现细胞及组织等实际样品中microRNA的准确定量，在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用前景；3.通过在体外模拟生物体内基因的损伤修复，构建了一种能够产生生物发光信号的DNA纳米机器，实现了多种分析物的高灵敏高特异性均相检测，并验证了该方法适用于血清复杂样品基体；4.以ATP生物发光检测方法系统研究了E. coli连接酶对各种DNA底物的连接特异性，实现了对错配DNA的可控连接，并以此为基础，建立了可以同时检测DNA样品中已知突变与未知突变的高通量分析方法；5.构建了自猝灭三色DNA探针用于多种核酸酶的同时检测，并发展了多色荧光传感器阵列实现了复杂样品基体中的多种核酸酶、蛋白质的准确、快速区分。.项目执行期间，在Anal. Chem.和Chem. Commun.学术期刊发表论文5篇，协助培养硕士研究生3名，参加学术交流4次。