猪痘病毒江西株非必需区缺失及外源基因插入对其生物学特性的影响效应

Swinepox virus (SWPV) has a potential to become an excellent vaccine vector. The SWPV genome is large (146kb) and contains multiple non-essential region (NER), allowing the insertion of many large-sized foreign genes. Despite these favorable characteristics, there exist several major challenges in generating a SWPV-based vaccine vector. These challenges include the difficulties in the identification of virulence genes, identification of foreign gene insertion sites, and screening of strong promoters. Such a vaccine vector is also required to express high expression level proteins with strong immunogenicity. In this project, many genetically engineered vector candidates will be generated by mutating NER of the Jiangxi isolate genome using double-joint PCR and homologous recombination, and then the biological characteristics of mutant SWPV will be analyzed. Optimal foreign gene insertion sites will be identified by screening and comparing different NERs based on a variety of biological characteristics. To evaluate the engineered vectors in vitro and in vivo, we will generate recombinant SWPV strains expressing capsid protein of Porcine circovirus type 2 (PCV2). Pigs will be immunized, followed by comparative analysis of gene expression and immunogenicity levels of recombinant capsid protein. This project is expected to obtain a series of NERs for construction of ideal SWPV-based live vaccine vectors that will significantly promote effective vaccine development in future.

猪痘病毒（SWPV）具有基因组大、复制非必需区（NER)多、宿主特异性严格、可插入大片段外源基因等特点，使其特别适合作为疫苗载体。但SWPV作为疫苗载体的关键问题有待解决，如合适NER的筛选、不同NER对外源基因表达及免疫学特性的影响、强启动子的筛选、毒力基因的鉴定等。本项目拟以SWPV江西株为亲本病毒，采用融合PCR、线性DNA同源重组等技术，构建一系列的NER缺失毒株，并分别测定其生物学特性；在此基础上，选择不同的NER分别插入PCV2 ORF2基因，构建表达PCV2衣壳蛋白的重组SWPV，并分别测定其外源蛋白的表达及免疫学特性。本项目将筛选、鉴定出SWPV的一系列NER，解析不同NER的生物学功能；通过系统分析不同NER对插入外源基因的体内外表达及免疫学特性的差异，优选出稳定、高效表达外源基因的NER；分析不同NER与SWPV毒力的相关性，以期发现适合构建SWPV活载体疫苗的NER。

猪痘病毒（SWPV）具有基因组大、复制非必需区（NER)多、可插入大片段外源基因等特点，使其特别适合作为疫苗载体。本项目对二株猪痘病毒江西分离株进行了全基因组测序，结果SWPV-JX08株基因组全长为146297bp，SWPV-JX20G株基因组全长为146240bp。在此基础上，对JX20G株的65个位点进行缺失，构建了65株猪痘病毒NER缺失毒株，结果表明这65个位点均为SWPV的复制非必需区（NER)。对其中23株NER缺失毒株进行了PCV2-Cap表达量、荧光斑大小、对猪的致病性和免疫保护等生物学特性测定，筛选到7个高表达外源基因的位点（ORF008、ORF009、TK、ORF107、ORF121、ORF141和ORF143），这些位点均可作为SWPV载体表达系统的外源基因插入位点。.　　在表达绿色荧光蛋白（EGFP）的基础上，筛选到9株抗EGFP单抗，为比较启动子的强弱提供了单抗工具。目前，用于痘病毒载体的强启动子甚少，常用的痘病毒强启动有P11和P28。为筛选到SWPV强启动子，本项目对SWPV基因组中的所有启动子（146个）逐个进行了筛选，猪瘟病毒基因组中不同启动子的启动效果差异巨大，成功筛选到6个强启动子（P150、P69、P33、P26、P67和P109），为今后构建多启动子-多拷贝SWPV表达系统高效表达外源基因提供了充足的强启动子。.　　基于本项目筛选到的猪痘病毒多个高表达位点和强启动子，初步完成了高效表达外源基因的猪痘病毒表达载体的构建，如今后通过进一步的优化研究，猪痘病毒有望成为与杆状病毒载体媲美的真核表达系统，并应用于蛋白的真核表达和动物亚单位疫苗的研发。在本项目研究的基础上，本项目组正与3个单位合作开展“猪圆环病毒2型重组猪痘病毒载体灭活疫苗”的研发。