三肽囊素高密度模拟表位的构建及其模拟机理研究

三肽囊素是一种存在于禽法氏囊中的三肽活性物质,对禽和哺乳动物均有免疫增强活性。由于天然三肽囊素来源有限，人工合成成本高等原因，限制了它在养殖业的应用。本课题组的前期研究表明：不仅表达于噬菌体表面的三肽囊素模拟表位具有免疫增强活性，而且根据其氨基酸序列人工合成的模拟表位七肽对鸡也具有免疫增强作用。本项目拟在研制一系列高质量三肽囊素单抗的基础上，以单抗为靶分子从噬菌体随机肽库中淘选，获得高免疫增强活性的模拟表位；采用分子生物学方法，将模拟表位导入M13噬菌体的主要衣壳蛋白pⅧ上，获得高效扩增的高密度分子模拟表位，以期能作为三肽囊素的低成本、高效免疫增强功能替代品。若本项目成功将建立"小分子生物活性物质→单克隆抗体→模拟表位→高密度模拟表位→活性功能替代品"的模型。利用蛋白质结构分析软件分析三肽囊素模拟表位肽结构与免疫增强生物学活性的关系，探究模拟表位肽在模拟三肽囊素免疫增强活性方面的模拟机理。

基于三肽囊素（Bursin,KHG-NH2)分子C端的氨基决定其免疫增强活性，本项目采用EDC和SMCC法将三肽囊素分子N端的氨基定向偶联至载体蛋白（BSA、OVA），分别制备了带有不同偶联臂的三肽囊素人工抗原。将三肽囊素人工抗原免疫BALB/c小鼠，采用单克隆抗体技术，获得了18株抗三肽囊素单克隆抗体，根据18株单抗与不同三肽囊素人工抗原的结合特性、三肽囊素及其类似物的阻断效果、IC50值的差异，确定单抗11C4和2D2适合用于模拟表位的淘选。.　　以单克隆抗体11C4和2D2为配体，从随机七肽和十二肽库中淘选三肽囊素模拟表位，筛选到227个阳性噬菌体克隆，并进行测序，共获得25种模拟肽序列，对其中14种模拟表位肽分别进行了工合成，并分别测定其IC50值，筛选到能与三肽囊素特异性竞争结合单抗11C4/2D2的二种模拟表位（M42、K02），并分析确定M42的核心肽序列为“IFQHPA”。.　　为了解M42和K02能否模拟三肽囊素的免疫增强活性，将不同浓度三肽囊素、M42和K02模拟表位肽分别加入到杂交瘤细胞培养液中，继续培养24h，分别测定细胞培养液中的抗体含量。结果显示三肽囊素、M42和K02均明显提高杂交瘤细胞的抗体生成，比对照组提高40%左右。将三肽囊素、M42和K02（5μg/只鼠）分别加入到猪圆环病毒（PCV2）衣壳蛋白抗原中，免疫小鼠，免疫后每周采血，测定小鼠血清中的PCV2抗体水平。结果表明模拟表位M42使免疫小鼠快速产生高水平抗体，其免疫增强作用与铝胶佐剂相当，免疫后21d达到/接近抗体水平峰值（比油佐剂提前2周）。本项目成功构建了高效共表达M42和PCV2衣壳蛋白的重组猪痘病毒，为M42作为免疫佐剂在动物疫苗的应用打下了基础。上述结果表明：M42具有三肽囊素的体内外免疫增强活性，有望作为三肽囊素的生物学活性功能替代品应用于动物疫苗中。.　　为探究三肽囊素/M42对哺乳动物的免疫增强作用机制，通过Bursin-FITC和　M42-FITC对猪和鸡脾细胞的荧光染色方法，初步证明猪和鸡脾脏中存在三肽囊素/M42受体细胞；采用竞争ELISA方法初步确定在猪淋巴结和脾脏中存在较高含量的“三肽囊素样”免疫活性分子。由此可大胆推测：猪“三肽囊素样”免疫活性分子作用于相应受体，发挥与禽类三肽囊素类似的免疫调节作用。