去miR-9作用增强靶向防龋DNA疫苗免疫效果和机制研究

MicroRNAs are cellular non-coding single-strand small RNA. MicroRNAs inhibits target gene expression. Translation of DNA vaccine may be also subject to the regulation of microRNAs in cells. Our preliminary studies showed that miR-9 inhibited the expression of antigen encoded by targeted fusion anti-caries DNA vaccine. We will take advantage of microRNA sponge (a microRNA inhibitor) to suppress the inhibition effect of miR-9, and then increase the expression of antigen and the immune responses. In addition, miR-9 also inhibits the expression of NFKB1, a key regulator of the maturation of dendritic cell. Therefore, suppression of miR-9 will also up-regulate NFKB1 and promote the maturation of dendritic cell and the induction of immune responses. We will also use RNA-seq technique to explore the effects of miR-9 suppression on the gene expression profile of dendritic cells. Our study may also provide new method for the development of other DNA vaccines.

MicroRNA是一类重要的内源性非编码单链小分子RNA，主要能抑制靶基因的表达。DNA疫苗免疫机体后在细胞中表达是引起免疫反应的基础，其表达同样也可受到microRNA的调控。项目组前期研究表明miR-9可以抑制靶向融合防龋DNA疫苗编码蛋白的表达。本项目将利用microRNA的抑制剂microRNA海绵，抑制miR-9的表达，去除miR-9对靶向融合防龋DNA疫苗编码蛋白表达的抑制作用，提高该蛋白的表达水平，从而增加对免疫系统的刺激，增强免疫效果。另外，miR-9对树突状细胞成熟的重要调控分子NFKB1的表达也有抑制作用。抑制miR-9也可增强NFKB1的表达，从而增强树突状细胞的成熟，有利于特异性免疫反应的诱导。本项目还将利用RNA测序等技术研究抑制miR-9对树突状细胞基因表达的影响，探索其增强免疫效果的机制。本项目将也可能为增强其它DNA疫苗的免疫效果提供新的方法。

龋病是人类最常见的口腔疾病之一。防龋DNA疫苗可以诱导机体产生抗龋免疫反应。如何提高疫苗免疫效果是许多DNA疫苗面临的共同问题。microRNA是一种在进化过程中高度保守的非编码RNA，在许多生理和疾病过程中有重要作用。microRNA的主要作用是结合靶基因并抑制靶基因的表达。DNA疫苗编码的抗原的翻译表达也可能受到microRNA的调控。本项目研究了是否可以通过抑制内源性miR-9的作用，提高防龋DNA疫苗编码的抗原的蛋白表达，从而增强特异性免疫反应。本项目发现：1）针对miR-9的海绵表达质粒，可以明显提高防龋DNA疫苗编码的融合蛋白抗原的表达水平,同时也可以提高miR-9的靶基因FoxO1和CDH1的表达水平。为提高海绵质粒转染细胞的效率，我们还研发了一种新型高效的细胞转染方法，即半贴壁法，已经申请专利。2）在树突状细胞中，抑制miR-9可以提高树突状细胞成熟相关基因CD80的表达水平，说明miR-9在一定程度上参与了树突状细胞成熟的过程。3）首次发现抑制miR-9的功能可以显著增强防龋DNA疫苗的免疫效果，证实了本项目的关键科学假设，为增强DNA疫苗的免疫效果提供了很好的思路。4）通过RNA-seq和生物信息学分析，我们发现一些非编码RNA和免疫相关基因可能是miR-9的新的靶基因。另外，靶向防龋DNA疫苗可以ceRNA的方式增加免疫相关基因p50的表达。5）除了miR-9，miR-144和miR-29c也可抑制防龋DNA疫苗所编码的融合蛋白表达，从而可能影响其免疫效果。6）RNA结合蛋白PCBP1可能对靶向防龋DNA疫苗的蛋白表达有潜在的调控作用。这些研究结果为DNA疫苗在体内的抗原表达调控机制，和增强DNA疫苗免疫效能提供了新思路。