基于泛素-蛋白酶体途径的EGFR-TKIs获得性耐药新机制及其逆转方法的实验研究

EGFR-TKIs are the pioneering breakthroughs in lung cancer therapy. Unfortunately, the development of acquired drug resistance severely restrained their clinical applications. EGFR signaling and its downstream MAPK and anti-apoptotic proteins have been reported in resistant lung cancer cells while manipulating these targets partly restored EGFR-TKIs sensitivity. These results indicated that combined inhibition of EGFR signaling by EGFR-TKIs and other intervention strategies might overcome acquired resistance. Our preliminary study showed FBW7 (a member of ubiquitin proteasome pathway) is a promising target to reverse drug resistance. The present study aims to investigate roles of FBW7 and other UPP members during acquired EGFR-TKIs resistance. We intended to identify association between UPP and drug resistance through yeast two-hybrid, co-immunoprecipitation, plasmids reconstruction and transfection, which might shed light on the involvement of UPP during cancer cell drug resistance and offer novel approaches to reverse acquired EGFR-TKIs resistance..

EGFR-TKIs是肺癌治疗领域划时代的发现，不幸的是获得性耐药严重限制了该药物的临床价值。耐药细胞内EGFR信号及其下游的MAPK和抗凋亡蛋白等分子含量异常升高，下调这些蛋白含量部分恢复肿瘤细胞对EGFR-TKIs的敏感性，提示EGFR-TKIs联合其它措施共同抑制EGFR介导的肿瘤细胞生长信号有望克服耐药难题。我们前期研究表明调控泛素-蛋白酶体途径（UPP）成员FBW7是逆转EGFR-TKIs获得性耐药的潜在靶点。本课题将深入研究FBW7及UPP其它成员在肺癌细胞EGFR-TKIs获得性耐药中的作用，通过酵母双杂交、免疫共沉淀、基因重组和基因转染等方法筛选出可能介导耐药的关键分子，查明UPP生物学特征与耐药的关系，旨在从UPP角度揭示EGFR-TKIs获得性耐药新机制，开辟UPP与肿瘤细胞耐药研究新领域，为临床解决肺癌细胞EGFR-TKIs获得性耐药难题提供新思路和途径。

泛素蛋白酶体通路（UPP）是真核细胞降解蛋白质的重要方式，F-box protein负责识别并结合底物蛋白，是调控UPP最重要的环节。FBW7是一个重要的F-box protein，研究发现FBW7可以降解c-Myc，cycline E，c-Jun等癌蛋白且在多种肿瘤中处于低表达状态，提示FBW7可能作为抑癌基因用于肿瘤治疗。本课题重点研究了FBW7与非小细胞肺癌（NSCLC）靶向TKIs治疗敏感性的关系和分子机制，我们发现FBW7在耐药标本中表达减少，细胞水平下调FBW7表达亦能引起耐药表型，并且耐药细胞不依赖经典的PI3K/Akt和MEK/Erk信号。通过siRNA逐个下调FBW7底物蛋白，我们发现MCL-1是FBW7缺失后引起耐药的关键分子，体内和体外泛素化实验证明FBW7通过K48依赖的泛素化降解MCL-1，后者活化内源性凋亡信号杀伤肿瘤细胞。我们通过生物信息学和分子生物学实验鉴定出MCL-1两个新的泛素化位点，即K279和K308，当把这两个位点突变后FBW7泛素化MCL-1能力降低。然而FBW7主要定位于细胞核而MCL-1定位于细胞质，两种时空不同蛋白相互作用的机制是本课题的另一研究重点。形态学、生物化学和细胞定位成像等方法证实MCL-1在TKIs作用后入核增加，并且这种胞浆到胞核的时空转化依赖于GSK3β对Ser159位点磷酸化，这种磷酸化过程首先依赖Erk对MCL-1 Thr163位点磷酸化，第二步再被GSK3β对磷酸化，两步磷酸化步骤完成后MCL-1蛋白进入细胞核才能和FBW7结合被降解。MCL-1磷酸化入核降解的步骤解释了FBW7引起的PI3K/Akt和MEK/Erk非依赖机制：TKIs作用于NSCLC细胞阻断PI3K/Akt信号并恢复GSK3β的激酶活性，随后的MCL-1入核降解过程直接导致细胞凋亡。因此，本课题发现了TKIs引起NSCLC细胞凋亡的更下游分子机制，对于后续克服耐药有一定指导意义。最后，我们鉴定出一个可以上调FBW7表达的药物Oridonin，Oridonin和TKIs联合可以有效逆转FBW7表达减少引起的耐药，在体内体外诱导细胞凋亡。综上所述，本课题发现了FBW7调控TKIs敏感性的作用和分子机制，恢复TKIs表达有助于克服靶向治疗耐药。