水稻广谱抗稻瘟病基因Pi65(t)的克隆及功能分析

Abstract：Rice Blast is one of the most important diseases in rice production. To control the disease, detecting rice blast resistance genes and breeding some good varieties is a cost-effective way. Present our research is weak in detecting and utilizing rice blast resistance genes from japonica rice resources. In the previous study, using Gangyu129, a japonica rice cultivar with broad-spectrum resistance in high incidence disease area of Liaoning province, Pi65(t) have been mapped and located to 30.2-31.2M in Chr11, and many resources with the gene under different genetic background have stable and highly resistance to rice blast. Despite the progress in previous research, it is unclear that if Pi65(t) is a new type of gene and the pathway it regulate. Based on previous studies, this research tries to carry out the followed studies in depth: The first, we want to cross the backcross populations and select recombinants to map the gene deeply. The second, we try to forecast the candidate genes according functional annotation and patterns of gene expression. The third, we want to prove the genes' function by genetic transformation and detect the regulatory pathway of the gene using RNA-seq technique. Our study is scientifically and practically important to detect rice blast resistance genes, clarify the resistance mechanism of Pi65(t) and breed japonica rice varieties with resistance to rice blast disease.

稻瘟病是水稻生产上最重要的病害之一，发掘抗稻瘟病基因并应用于抗病品种选育是经济有效的防控途径，而我国在粳稻资源抗稻瘟病基因发掘和利用方面仍较为薄弱。申请人前期选用辽宁病害重发区多年多点表现广谱高抗性的粳稻材料港育129，利用Super-BSA技术定位到一个抗病基因Pi65(t)，位于第11染色体30.2-31.2M间，该基因在不同背景下可表现出稳定的高抗性，但Pi65(t)是否为新的抗病基因类型，其通过参与何种代谢途径调控水稻对稻瘟病菌的抗性等仍不明确。为此，本申请拟在前期基础上深入开展以下研究：1）利用回交群体鉴定重组子，精细定位该基因；2）根据基因功能注释和表达模式确定候选基因；3）通过遗传转化验证候选基因功能，并结合转录组测序技术研究该基因的调控谱。该研究对揭示抗病基因Pi65(t)的抗病机制，发掘和利用抗稻瘟病基因资源，进而选育抗稻瘟病粳稻品种具有重要的科学意义和实用价值。

稻瘟病是对水稻生产具严重威胁的真菌病害。培育并推广抗稻瘟病水稻品种是解决这一问题的根本途径。尽管抗稻瘟病基因的定位、克隆及应用已取得显著进展，但从粳稻中发掘的抗病基因较少。港育129是一个在辽宁地区多年多点对稻瘟病表现高抗的粳稻品种，前期已利用Super-BSA技术从该品种中定位到一个抗稻瘟病基因Pi65(t)，位于第11染色体30.2-31.2M间，该基因在不同背景下可表现出稳定的高抗性。本研究在其基础上确定了候选基因，并通过遗传转化验证了目的基因的功能，结果如下：. 1. 基因的精细定位：构建回交群体，从群体中筛选重组子，结合重组子的表型将抗稻瘟病基因Pi65(t)精细定位于Chr11:30.57–30.63Mb范围内，该区域包含4个候选基因。.2. 候选基因筛选及功能验证：构建4个基因的敲除载体转化于抗病亲本，对获取的纯合转化子进行抗病鉴定发现，当Os11g0694600的等位基因从港育129中被敲除后转化子感病。而将该等位基因克隆转入感病亲本辽星1号时，转化子抗病，进而确定Os11g0694600的等位基因为对港育129稻瘟病抗性具主效贡献的Pi65。.3. Pi65表达模式分析： Pi65在圆锥花序，穗轴、叶、茎和鞘部位均有表达，但不同器官间表达量有差异，表达水平最高的是叶，最低的是圆锥花序。接种稻瘟病菌后叶片中Pi65的表达显著被诱导，其表达量为未接种时的100倍以上。.4. Pi65的单倍型分析：该基因在73份中国粳稻材料和2份籼稻材料中存在3种单倍型，即Hap1（Pi65）、Hap2和Hap3。单倍型Hap2与Hap1间序列差异较大，存在16个SNP，而Hap3与Hap1在编码区内只有1个SNP，位于CDS区第3300bp处，突变类型是G变为A，引起了错义突变。.5. Pi65的基因结构：Pi65包含2个内含子(2959 bp和386 bp)，cDNA由3483bp的ORF和42bp的3’UTR区组成，编码1102个氨基酸组成的蛋白质产物，该产物含有5个亮氨酸重复序列和一个酪氨酸激酶结构域。.6. Pi65介导的抗病分子机理：受稻瘟病菌胁迫时，Pi65敲除的突变体中，多个病原相关蛋白表达及参与抗病信号传递的转录因子在接种后24小时显著下调，而在港育129野生型中这些基因的表达量上调或不变，表明Pi65在稻瘟病菌信号识别中起关键作用。