回药治疗脑卒中核心药对（胡椒+荜拔）物质基础及突触神经元保护作用机制研究

The research has determined the core paired -component in the treatment of stroke with Hui medicine, through prophase literature research, clinical research, pharmacodynamic study (Fructus Piperis Nigri and Piper longum Linn,the two drugs are equivalent to the monarch drug of traditional Chinese medicine prescription) . On the basis of cell and animal exprement research, we will extract and separate effective material of three levels ( effective part ,effective components and active component ) with modern extraction and separation technology.Furthermore monomers chemical structure will be identified by spectroscopy testing technology. Examine the effects of pharmacodynamic substance basis of three levels on synapse neurons ultrastructure and calcium overload-glutamate excitotoxity pathway.The protein expression of Synapsin- Ⅰ, a-synuclein, PSD-95, CaM, CaMK, p-CaMKHa and NMDA2B will be observed. The correlation is discussed among substance basis,pharmacological action and mechanism.The mechanism of substance basis is described from the point of protective effects on synapse neurons. This study can deepen the scientific cognition about curative effect of the traditional medicine prescription and enrich the Hui medicine content .At the same time ,the research provide reference on the further study and develop modern preparation with better clinical effects in the Hui medicine.

本项目前期通过文献研究、临床研究、药效研究，确定了回药治疗脑卒中方剂中的核心药对（胡椒+荜拔，相当于中医方剂的君药）。在此基础上，本研究结合细胞及动物活性筛选模型，采用现代提取分离技术对"核心药对"治疗脑卒中的有效部位、有效组分、有效成分三个层次药效物质进行化学分离，采用波谱学测试技术确定单体化合物的化学结构；考察三个层次药效物质基础对突触神经元超微结构、钙超载-谷氨酸兴奋毒性通路的影响，检测Synapsin-Ⅰ、a-synuclein、PSD-95、CaM、CaMKⅡ、p-CaMKHa、NMDA2B蛋白的表达，从突触神经元保护这一角度阐述物质基础的作用机制，探讨物质基础?药理作用?作用机制的相关性。本研究可深化对疗效确切的传统回医药方剂的科学认知，丰富回医药学内容，同时为进一步研究与开发出临床效果好的回药现代化制剂提供参考。

本项目按照预定的实验方案进行，项目目标及考核指标均顺利完成。通过本项目研究得到如下实验结论：.1. 采用CO2超临界萃取技术结合溶剂萃取法制备不同部位，采用pMCAO动物模型对各部位进行活性筛选。动物实验显示，胡椒、荜茇二氯甲烷萃取部位为其有效部位，CO2超临界萃取部位有部分成分与二氯甲烷萃取部位重叠，理论上应为有效部位，但因其毒性太大，剂量过大时，动物大量死亡，在安全剂量范围内无效。正丁醇、水萃取部位均无效。.2.GC-MS鉴定挥发性成分32个，从CO2超临界萃取部位和二氯甲烷部位中共分离鉴定化合物31个。.3. 从二氧化碳超临界萃取部位共选出14个单体化合物进行活性筛选，从二氯甲烷萃取部位共选出10个单体化合物进行活性筛选，二者无化合物重叠。实验结果显示24个化合物中17个单体化合物对OGD损伤皮层神经元细胞有保护作用。其中，Pipercyclobutanamide G 和 dibutyl phthalate活性最好。.4. 胡椒、荜茇二氯甲烷萃取部位、胡椒碱对大鼠局灶性脑缺血具有神经保护作用（14d内），能够改善缺血动物神经功能缺损症状；二氯甲烷萃取部位对大鼠脑缺血神经元具有保护作用（14d内），减轻因缺血造成的神经元死亡和尼氏小体脱失；二氯甲烷萃取部位、胡椒碱高剂量组能增加皮层、海马部位的PSD-95、synapsin-I表达，并减少α-synuclein的积聚，对大鼠神经元突触结构、功能具有保护作用； 二氯甲烷萃取部位能降低皮层、海马部位的MDA含量、IL-1β值、IL-6值和TNF-α值，并增加SOD活力，减轻缺血后脑组织脂质过氧化损伤和炎症损伤；二氯甲烷萃取部位能够增加PSD-95、p-CaMK II、CaM、NR2B蛋白的表达，对抗缺血引起的突触功能损伤，胡椒碱高剂量组能明显增加p-CaMK II蛋白在皮层的表达，对其他蛋白无影响。