生精细胞凋亡过程中ndrg2基因表达及功能意义的深入研究

Ndrg2是该基因家族中新发现的与细胞增殖、分化及凋亡相关的基因。本课题组前期研究首次证实了NDRG2在凋亡睾丸间质细胞和生精细胞内有较高水平的表达，推测该基因可能对生精细胞凋亡和精子发生起到重要调控作用，因此本课题拟应用ndrg2基因敲除、ndrg2基因睾丸细胞特异性敲除小鼠以及慢病毒介导稳定转染过表达或干涉ndrg2载体的生精细胞凋亡模型，观察ndrg2对生精细胞凋亡的影响和对睾丸功能表型等生殖生理学变化；利用荧光素酶报告基因系统、ChIP、EMSA完善其调控网络，通过蛋白质双向电泳、GST-pulldown和免疫共沉淀探索NDRG2在凋亡生精细胞中的核转位机制，以证实NDRG2在凋亡生精细胞表达的作用及影响精子发生的机理。本课题的开展将在国际上首次建立ndrg2基因敲除动物模型，并为深入理解NDRG2在男性不育症和精子发生障碍等疾病中的作用、预防和靶向治疗上述疾病提供理论依据。

不育症的发病原因相当复杂，使得临床针对它的治疗和诊断非常困难。男性不育症患者又多伴有睾丸内细胞凋亡的特点，因此，研究睾丸细胞凋亡的机制对理解不育症的病因有重要意义。NDRG2基因在细胞增殖、分化及凋亡中扮演着重要角色，但NDRG2与睾丸细胞凋亡的关系函待阐明。本课题通过结合临床不育症患者睾丸穿刺活检标本，以及多种基于ndrg2基因敲除、过表达小鼠的睾丸细胞凋亡动物模型等研究发现，NDRG2在正常成年男性或鼠类睾丸的间质细胞表达较多，而在睾丸支持细胞和生精细胞NDRG2的表达量较低；但在非梗阻性无精症、唯支持细胞综合症的患者以及MAA、隐睾、EDS、电离辐射诱导凋亡的睾丸间质或生精细胞中均有表达。此外，在睾丸间质细胞中，ndrg2基因启动子区存在NF-κB调控位点，NF-κB的结合可以上调NDRG2表达。体外抑制NDRG2可以降低间质细胞凋亡率，而过表达NDRG2可促进EDS诱导的间质细胞凋亡。ndrg2敲除小鼠在生殖系统各方面检测中与野生型无显著差异；而在 EDS 、隐睾和电离辐射模型中，ndrg2敲除后小鼠睾丸细胞对凋亡刺激的反应较野生型出现明显变化。EDS 处理后，ndrg2敲除小鼠间质细胞数量明显多于野生型。TUNEL 凋亡检测证实上述细胞组分变化原因是睾丸细胞对凋亡刺激在敲除型中较野生型不敏感。免疫组织化学检测凋亡相关信号显示，NDRG2在 EDS 处理、电离辐射等模型中激活；NF-κB在敲除型和野生型中对凋亡刺激的表达发生改变。 PCR-array 检测的84个凋亡相关基因发现了12个基因敲除后表达发生显著改变。利用免疫电镜技术我们报道了 NDRG2在睾丸细胞超微结构的定位。NDRG2不仅可以定位于细胞质线粒体外周，还能够定位于生精细胞、支持细胞的胞核。过表达NDRG2小鼠的生育能力显著下降，睾丸组织学检查发现精子发生严重损害，部分区域出现生精停滞。TUNEL 及凋亡因子组化结果证实睾丸自发性细胞凋亡较野生型显著增加。本课题阐明了NDRG2参与睾丸细胞凋亡的途径，以及在不育患者标本、多种睾丸细胞凋亡动物模型中，NDRG2对睾丸细胞凋亡的影响及其上下游信号网络，为临床男性不育的发病提供了新的治疗靶点。