TLR4和NLRP3在化脓隐秘杆菌溶血素致炎症过程中的作用研究

Trueperella pyogenes (T. pyogenes) associated diseases, such as bovine respiratory disease syndrome, often cause huge economic losses to livestock and poultry industry. However, the pathogenic mechanism of T. pyogenes is not well studied. PLO (pyolysin) is the most important virulence factor of T. pyogenes. However, the toxicity of PLO is poorly explained by its cytolytic action alone up to this time. In a preliminary work of current study, we have expressed recombinant PLO (rPLO) with cytolytic action in Escherichia coli. And, then, we found that treating macrophages with rPLO at sublethal dose induced the release of proinflammatory cytokines and led to posstium efflux. Thus, to test the hypothesis that PLO up-regulate the expression of proinflammatory cytokines through activating TLR4 and NLRP3 pathways and the mechanism underlying, TLR4 or NLRP3 deficient macrophages will be treated with rPLO, and the expression of proinflammatory cytokines and activating of caspase-1 will be detected in this study. Our results will be beneficial to gain further insight into the pathogenic mechanism of T. pyogenes and the role of PLO in the process of infection and provide instructions for the development of methods for preventing and treating T. pyogenes infection.

化脓隐秘杆菌可导致牛呼吸道疾病综合征等疾病，给养殖业造成巨大经济损失，然而其致病机制尚不明确。溶血素(PLO)是化脓隐秘杆菌最重要的毒力因子，已有研究多以PLO的溶细胞作用为着眼点论述其毒力效应。在本研究的前期工作中，我们利用原核表达系统表达了具有溶细胞活性的重组PLO（rPLO）蛋白，并发现亚致死剂量rPLO能够诱导小鼠巨噬细胞促炎性细胞因子表达上调及导致细胞钾离子外流。在此基础上，本研究拟以鼠源TLR4或NLRP3缺陷型巨噬细胞为模型，对PLO上调巨噬细胞促炎性细胞因子表达和分泌的机制以及TLR4和NLRP3在此过程中发挥的作用进行研究，力图揭示PLO在化脓隐秘杆菌导致的感染性炎症中发挥的作用，从宿主免疫系统对PLO免疫反应角度阐释PLO的毒力效应。本研究将为深入了解化脓隐秘杆菌的致病机制及化脓隐秘杆菌感染新型防控手段的开发提供数据支撑。

化脓隐秘杆菌是多种动物的条件性致病菌，其导致的疾病以组织或器官的炎症性损伤为主，其中肺炎是其感染导致动物死亡的最主要原因之一。因此，研究化脓隐秘杆菌与肺组织中介导炎症反应的重要免疫细胞之一——巨噬细胞之间的相互作用，对于全面揭示化脓隐秘杆菌的致病机制具有重要意义。溶血素蛋白（PLO）是化脓隐秘杆菌最重要的毒力因子。本项目以小鼠骨髓衍生的巨噬细胞（BMDMs）为模型，探讨了PLO影响巨噬细胞中促炎性细胞因子表达的部分分子机制。本研究证实，PLO处理可导致BMDMs中IL-1β和TNF-α表达的上调，这种对促炎性细胞因子的上调作用与其成孔活性直接相关。同时，证明了PLO处理可导致BMDMs中caspase-1活化，进而促进IL-1β成熟，可能是PLO介导炎症发生的机制之一。针对上述现象的深入研究表明，PLO在BMDMs上形成的穿膜孔道使细胞内K+以自由扩散的方式向胞外流动，导致细胞内K+浓度降低。K+浓度的降低可导致NLRP3蛋白向线粒体定位，该过程是NLRP3炎症小体活化的一个步骤，而高浓度氯化钾可抑制NLRP3蛋白向线粒体募集。敲减NLRP3蛋白可显著抑制PLO处理导致的caspase-1活化和IL-1β成熟，表明NLRP3炎症小体是介导PLO处理的BMDMs中caspase-1活化和IL-1β成熟的核心成分。进一步研究表明，PLO处理的BMDMs中caspase-8活性变化不显著，明确了caspase-1在PLO处理介导的BMDMs中IL-1β成熟此过程中的作用。本研究为全面了解化脓隐秘杆菌的致病机制提供了部分理论依据。