lncRNA Rian在肺癌发生中的作用及与miR-370互作机制研究

Abnormal expression of non-coding RNA cause dysregulated expression of cellular oncogenes and tumor suppressors leading to tumorigenesis. Our previous study haves shown lncrna Rian locates in Dlk1-Gtl2 genomic region, which is the most important gene regulating loci, meanwhile, Rian significantly upregulated in various tumor including lung cancer; miR-370 coding by Rian act as tumor suppressor and can interact with Rian. These findings suggest Rian have effect in lung cancer but the mechanism is unclear. To investigate the role and mechanism of Rian, this project is ready to study the role of Rian during lung tumorigenesis by using overexpression, shRNA interference, gene knocking down cell line etc in both in vitro and in vivo level; meantime the crosstalk between miR-370 and Rian and the effect on tumorigenesis is also studied. These studies would offer the experiment data to clarifying the function of Rian, in addition, it can bring some novel understanding of crosstalk and feedback regulation mechanism between miR-370 and Rian.

非编码RNA的异常表达引起细胞内癌基因或抑癌基因受到异常调控从而导致肿瘤发生。我们前期的研究发现印记基因lncRNA Rian位于小鼠基因组最重要的基因调控区Dlk1-Gtl2内，并在多种癌症包括肺癌肿瘤中显著上调，Rian编码的miR-370是肺癌发生中的癌基因并可能与Rian相互作用。这些结果提示Rian在肺癌发生中具有作用但机理不明。为阐明Rian在肺癌发生中的作用及机制，本项目拟在Lewis肺癌模型上，通过超表达、shRNA干扰、基因缺失细胞株、miRNA封闭海绵、慢病毒感染等手段，在体外和体内两个水平研究Rian在肿瘤发生中的作用；同时研究Rian和miR-370相互调节和相互作用机制，并探讨该互作机制对肺肿瘤发生的影响。上述研究不仅为阐明Rian在肺癌中的作用提供实验依据，还为探讨lncRNA与自身编码的miRNA在肿瘤发生过程中的互作和调节机制提供新的认识。

肺癌是全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，深入全面地了解肺癌发生发展中的分子事件和分子机理,是寻找具有重要生物学功能的基因/蛋白作为治疗靶点的前提。近几年来，人们发现lncRNA在多种癌症包括肺癌的发生发展过程中发挥重要作用，使非编码RNA成为肺癌发病机理研究的热点.本项目拟计划研究长非编码RNA----Rian在肺癌发生中的功能及其与自身编码的小RNA----miR-370相互作用机制，然而在项目实施过程中，我们发现Rian的表达量比较低，无论是用普通酶还是高保真酶都无法扩增出来，这将影响后续的功能试验。于是我们从前期完成的高通量测序结果中，挑选了另外一个长非编码RNA----IncRNA F630028O10Rik（简称F63），它非常适合替代Rian作为本项目的研究对象。为达到研究目标，本项目的研究内容调整为IncRNA F63在肺癌发生中的功能及其与miR-223的互作机制。.本项目通过一系列分子生物学、细胞生物学实验，在体外细胞水平（in vitro）和体内小鼠水平(in vivo)两个层次证明：lncRNA F63具有抑制肿瘤血管的功能，具体表现为 F63在转录和翻译水平直接抑制血管生成的重要基因VEGFα，并且对血管生成的重要细胞----血管内皮细胞（MS1）的增殖、迁移、侵袭、克隆形成、管腔形成具有抑制作用，从而抑制肿瘤血管的生成。此外，在lncRNA和microRNA互作方面我们也开展了相关实验，为研究F63和miR-223是否具有结合，我们通过荧光素酶双报告系统发现F63与miR-223在核酸序列上发生直接结合；更有意思的是miR-223被抑制后，血管生成最重要的基因VEGFα的表达也被抑制；可见lncRNA F63通过抑制自身编码的miR-223，进而抑制VEGFα，发挥抑制肿瘤血管生成的功能。.这些研究成果为揭示lncRNA在肺癌发生中的功能以及lncRNA-miRNA之间的相互调节、相互作用的机制提供新的认识，也为发现新的lncRNA分子作为临床诊断标志物提供实验基础，对肿瘤的药物靶点设计、靶向治疗、基因治疗也具有重要的理论和实际意义。