结核分枝杆菌第二信使c-di-GMP合成和降解途径中重要酶的结构与功能研究

Mycobacterium tuberculosis is one of the major human pathogens and leads to approximately 3 million deaths annually. Upon the abuse of the antibiotics and other drugs, M. tuberculosis showed resistance to penicillium,as well as the multi-resistance to other antibiotics. The current vaccines could not efficiently prevent the infection of M. tuberculosis. Thus it is urgent to develop new antibiotics and/or vaccines. Recent reseach showed that c-di-GMP is a diffusible molecule that functions as a second messenger in bacteria including M. tuberculosis. However, little is known on the physiological function of c-di-GMP in M. tuberculosis. We will focus on the structure and function of Rv1357c and Rv1354c by X-ray diffraction and small angle X-ray scattering. The structure and function of the key enzymes involved in biosysthesis and degradation of c-di-GMP will help us to elucidate the molecular mechanism of homeostais of intracellular c-di-GMP, and provide structural insights into the development of novel antibiotics and/or vaccines.

结核分枝杆菌是人类的主要致病菌之一，随着结核分枝杆菌耐药株的出现以及免疫抑制剂的应用，现有的抗生素和疫苗已经不能有效地预防和控制结核病，因此开发新的抗生素和疫苗迫在眉睫。近年来在细菌中发现的第二信使c-di-GMP能够调控包括生物被膜形成、毒力、运动以及细胞分化等多种生理活动，因而其调控和信号转导途径成为研究的热点。结核分枝杆菌中c-di-GMP浓度由两个关键酶Rv1357c和Rv1354c控制，但分子机制不清。由于Rv1354c由三个相对构象柔性的结构域（GAF-GGDEF-EAL）组成，我们将整合蛋白质晶体学和X射线小角散射对其全长和各个结构域的结构和功能进行研究，以期阐明其调控c-di-GMP合成与降解的机理。该研究将有助于深入了解结核分枝杆菌的致病机理，为研究新型抗生素和疫苗提供理论指导。

c-di-GMP作为第二信使，在细菌中参与调控细胞分裂、生物膜形成和抑制毒力基因的表达，其稳态的维持对细菌的生长、生存和致病十分重要。因而，对c-di-GMP合成和降解途径中重要酶的研究有助于我们更好的理解c-di-GMP对细菌重要生理过程的调控，为新型疫苗和药物的研发奠定基础。. Rv1354c及其同源蛋白是分枝杆菌中非常保守的c-di-GMP合成和水解酶，一级序列相似性在60%以上，由GAF、GGDEF和EAL三个结构域组成。其中，GGDEF具有合成酶活性，将GTP合成为c-di-GMP；EAL具有水解酶活性，将c-di-GMP水解为pGpG。而GAF则是真核和原核生物中都普遍存在的信号感受结构域，通过感受环境变化或结合配体来调控蛋白中其他结构域的功能。我们以结核分枝杆菌中的Rv1354c及其在耻垢分枝杆菌中的同源蛋白MSMEG_2196为靶标，分别表达了全长、单结构域、串联双结构域及活性位点突变体蛋白，通过优化表达得到了Rv1354c全长和单独GGDEF结构域的晶体，并进行了优化。此外，我们通过酶活实验证明Rv1354c和MSMEG_2196在体外都具有双功能酶活性。并且，MSMEG_2196单独的GGDEF不具有合成酶活性，需要GAF的辅助；单独的EAL也仅有微弱的水解酶活性，需要其他结构域辅助以获得最大活性。我们还首次发现MSMEG_2196中GAF结构域的配体是GDP，GDP的结合可以别构抑制合成酶活性和促进水解酶活性。. 有文献报道c-di-GMP合成酶定位在细菌的分裂极或隔板处，可以通过阻碍肽聚糖合成而抑制细胞分裂。但对第二信使调控肽聚糖合成的研究还很匮乏，因此肽聚糖合成和水解相关的蛋白也是我们研究的重点。在肺炎链球菌中，LytA参与水解肽聚糖上N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之间的酰胺键，LytB则水解N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的糖苷键，LicA作为胆碱激酶在肽聚糖的合成过程中起作用。我们对这些蛋白结构和功能的研究为下一步研究第二信使对肺炎链球菌肽聚糖合成和水解的调控打下了基础，也为研发预防和治疗肺炎链球菌感染的药物提供了理论依据。目前，这些研究成果已发表在JBC、Acta D和PLoS ONE上。