肺炎链球菌胆碱合成代谢通路的结构和酶学研究

The major human pathogen Streptococcus pneumoniae is responsible for many infectious diseases, such as lobar pneumoniae, meningitis and bronchitis, which lead to approximately 1.6 million deaths annually in the world. The major virulencefactors include pneumococcal capsular polysaccharide, cell-wall fragments and hemolysin. Choline is an important chemical to constitute the pneumococcal cell wall and capsular. In addition, choline is also a nutrient required for thepneumococcal growth, normal transformability, the activity of autolysins, cell division and the anchoring a family of surface proteins which play important roles in pneumococcal infection. Therefore, the study of the pneumococcal choline catabolism pathway will help us to better understand the pathogenesis of S. pneumoniae.The pathway consists of eight proteins encoded by a gene cluster, termed lic. We aim to systematically solve the crystal structures of these proteins, and investigate their biological functions by using the methodologies of enzymology, microbiology and cell biology. The findings will elucidate the mechanism of pneumococcal choline catabolism pathway, andits contribution to the pathogenesis. Moreover, the structures will provide insights into the rational development of novel inhibitors and/or vaccines.

肺炎链球菌是引起人类疾病的重要病原菌之一，可引起大叶性肺炎、脑膜炎、支气管炎等疾病，导致全球每年约160万人死亡。肺炎球链菌主要的致病因子是肺炎球菌溶血素及细胞壁荚膜。胆碱是肺炎链球菌细胞壁和夹膜上的重要组分，同时也是其生长所必须营养成分。胆碱对肺炎链球菌的分裂、转化、自溶以及表面毒性相关胆碱结合蛋白的形成具有至关重要的作用,因此胆碱合成代谢通路的研究将有助于我们更好地理解其致病机制。肺炎链球菌的胆碱合成代谢途径主要由lic基因簇编码的8个蛋白质催化的生化反应所组成。我们以这些lic蛋白为研究对象，用X射线晶体学的方法解析各个单一蛋白及其复合物的三维结构，同时结合微生物学、细胞生物学、生物化学的手段研究其生化和生理功能，以期阐明肺炎链球菌的胆碱代谢途径的结构和酶学基础，从而为研制新型的肺炎链球菌抑制剂和疫苗提供理论指导。

磷脂酰胆碱可以维持细胞膜的稳定性和流动性，并在细菌性病理中发挥着重要作用。在肺炎链球菌中，胆碱分子只有在磷酸化以后才能在机体内发挥生理作用。胆碱分子首先从胞外通过LicB通道运到胞内，紧接着胞内的胆碱分子被胆碱激酶LicA磷酸化，再由LicC将磷酸胆碱转变成CDP-胆碱，然后由LicD1和LicD2将磷酸胆碱转移到磷脂酸和脂磷壁酸上。.我们解析了肺炎链球菌LicA全长的apo-form、LicA-胆碱及LicA-AMP-MES晶体结构，其LicA的酶活位点位于N端和C端的结构域之间的活性口袋内，可以将摄入的胆碱活化为磷酸胆碱，干扰免疫系统的对肺炎链球菌的识别。通过HPLC鉴定酶活，确认了P-loop上的E196A对酶活有重要作用。.LytA是肺炎链球菌中唯一被鉴定的酰胺酶，能够水解N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之间的酰胺键，引起肺炎链球菌在静止期发生自溶。我们解析了其分辨率为2.1 Å的全长结构。并通过酶活分析，证明胆碱结合位点对酶活是必不可少的。.磷酸胆碱转移酶可以将磷脂酰胆碱分别转移到细胞壁的磷壁酸和脂多糖的多糖链上的重复单元上。它的缺失或突变会导致肺炎链球菌细胞壁胆碱含量降低50%，我们使用荧光法检测LicD与其底物的相互作用，发现CDP-胆碱和GalNAc可能是LicD2的天然底物。