山羊捻转血矛线虫病中宿主NLRs通路介导病原分子识别的作用机理研究

Haemonchus contortus is the most important parasite which effect on the productive and physiological parameters of the ruminants especially sheep and goat. However, The mechanism of pathogen recognition and immune response is largely unknown in goat with Haemonchus contortus infection. In our previous studies, we found that NOD1 and NOD2, both the members of the NLRs family, are possible important candidate major genes for parasite disease resistance, using GWAS analysis of goat FECs trait with genomic SNP data. In this project, we plan to identify the relationship between host NLRs and the related genes with pathogenic molecules of H. contortus; further we will investigate the immune mechanisms mediated by host NLRs signaling pathway with H. contortus infection in goat. This study will reveal the mechanism of immune mechanism mediated NLRs signaling pathway against gastrointestinal parasitic disease infection. This study will contribute to suitable solution for small ruminants, since it can provide new candidate genes for goat breeding for parasite disease resistance.

捻转血矛线虫病严重影响山羊的生长发育与健康，培育抗病新品系和开发有效疫苗是两种具有可持续发展的解决途径；然而，目前宿主山羊识别病原分子的免疫应答全貌尚不清楚。申请者前期全基因组关联分析发现，NLRs基因家族成员NOD1和NOD2都位于影响山羊粪球虫卵计数性状的候选基因组区域内，结合文献报道可将NLR作为候选的抗寄生虫病基因。本研究拟一方面基于新的酵母双杂交技术RLL-Y2H进行高通量筛选与NLRs通路密切相关的宿主-寄生虫蛋白互作对，另一方面基于RNA-seq、ATAC-seq等组学技术鉴定山羊胃肠粘膜组织与宿主抗线虫感染相关的差异表达基因和调控元件，整合两方面结果挖掘NLRs通路参与识别线虫特定病因分子和介导免疫应答的遗传机制，最后在分子生物学和细胞生物学水平验证关键基因。本项目旨在阐明山羊捻转血矛线虫病中宿主NLRs通路介导识别病原的作用机理，为山羊抗寄生虫病育种提供新的候选基因。

捻转血矛线虫病严重影响山羊的生长发育与健康，给山羊养殖业造成严重损失。本项目以捻转血矛线虫为模型，在前期研究基础上，运用RLL-Y2H酵母双杂交技术与scRNA-Seq单细胞转录组等技术，探索了山羊捻转血矛线虫病中宿主NLRs通路介导病原分子识别的作用机理研究。主要结果如下：（1）基于上一基金结果的全基因组关联分析结果，本项目对NLRs家族的SNP功能进行验证，对189只中国山羊和191只孟加拉黑山羊进行数据收集，在包括NLRs家族成员的共12个候选基因中选取SNPs，发现其中4个基因（NLRC3、NLRC5、HIP1和LRP8）中的11个SNPs与山羊粪便虫卵数量性状显着相关（P<0.05）。（2）通过RLL-Y2H技术鉴定了67个捻转血矛线虫外分泌蛋白（ESP）和68个含NLRs基因的山羊免疫信号通路相关蛋白间的1,516个蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs），并绘制成PPIs网络，结合RNA-Seq数据，选取了交集基因构建蛋白互作网络，鉴定了NLRs、IL-17等重要免疫信号通路及MUC5AC，TRAF2等重要免疫蛋白。（3）构建人工感染山羊捻转血矛线虫动物模型，在外周血单个核细胞进行scRNA-Seq试验，鉴定了山羊外周血T细胞、B细胞、NK细胞等免疫细胞亚群，对不同亚群差异基因表达分析发现T细胞亚群表达多种Th2型免疫相关基因，单核细胞亚群表达多种免疫基因。通过对差异表达基因进行通路富集分析，T细胞GO富集至模式识别受体(PRRs)，细胞因子分泌，Toll样受体等条目。KEGG富集至NOD样受体信号通路，Th1和Th2细胞分化，TLR，IL-17，弓形虫病等通路，表明T细胞与单核细胞在捻转血矛线虫感染中起重要免疫作用，通过多种模式识别受体识别病原相关分子模式并激活下游通路，从而抵御病原入侵。本研究预期成果可为山羊寄生虫免疫提供基础数据，有助于培育抗性优良品系，故具有重要的意义。