基于趋化因子CXCL6的中药复方二黄颗粒抗糖尿病肾病肾间质纤维化机制研究

Renal interstitial fibrosis, mainly caused by the excessive deposition of extracellular matrix (ECM), is one of the foremost pathological features of diabetic nephropathy (DN). Renal interstitial fibroblasts are the principal effector cells responsible for ECM. From our previous studies, Er-huang granule, a Chinese compound formula provided by our hospital, exhibited a favorable effect in attenuating renal interstitial fibrosis of DN. It could reduce the CXCL-6 level in peripheral blood. The proliferation and CXCL-6 expression in glucose-induced rat renal interstitial fibroblasts were also significantly inhibited by Er-huang granule in vitro. However, the effect of CXCL-6 on the renal interstitial fibrosis remains unclear. This research aims at demonstrating the biological functions of CXCL-6 in glucose-induced renal interstitial fibroblasts and clarifying the mechanism of Er-huang granule attenuating renal interstitial fibrosis of DN based on the CXCL-6 at the molecular and cellular levels by data excavation, high-throughput sequencing, gene interference, co-immunoprecipitation, Q-RT-PCR and western blot analysis based on bioinformatics, serum pharmacology and molecular biology. This research will provide the experimental basis for diagnosis, treatment and prognosis of DN and also contribute new targets for drug development.

糖尿病肾病最主要的病理特征是肾间质纤维化，细胞外基质的过度沉积是其主要原因，肾间质成纤维细胞在其中起着重要作用。前期研究发现，中药复方院内制剂二黄颗粒具有良好的抗糖尿病肾病肾间质纤维化作用，明显降低病人外周血炎症趋化因子CXCL6水平。体外实验也发现明显抑制高糖诱导的肾间质成纤维细胞增殖及CXCL6表达。但CXCL6在糖尿病肾病肾间质纤维化过程中的作用目前并不清楚。本项目拟在前期研究基础上，综合生物信息学、血清药理学、细胞分子生物学等学科知识，运用数据挖掘、高通量测序、基因干扰、免疫共沉淀、Q-RT-PCR和Western blot等技术，研究CXCL6在高糖诱导的肾间质成纤维细胞中的生物学功能，从分子和细胞水平阐明中药复方院内制剂二黄颗粒基于CXCL6趋化因子的抗糖尿病肾病肾间质纤维化作用机制，以期为本病的诊断、治疗和预后提供实验依据，为药物研发提供新靶点。

糖尿病肾病最主要的病理特征是肾间质纤维化，细胞外基质的过度沉积是其主要原因，肾间质成纤维细胞在其中起着重要作用。本项目从分子、细胞和动物水平阐明中药复方院内制剂二黄颗粒基于CXCL6趋化因子的抗糖尿病肾病肾间质纤维化作用机制，以期为本病的诊断、治疗和预后提供实验依据，为药物研发提供新靶点。.实验结果显示，CXCL6在糖尿病肾病患者中表达水平显著升高；高糖可促进大鼠正常肾成纤维细胞（NRK-49F）增殖，且可促进NRK-49F细胞中CXCL6的表达；干扰CXCL6后，可部分阻断高糖对NRK-49F细胞增殖作用和促CXCL6表达作用，且降低了纤维化相关细胞因子的表达，而CXCL6过表达后，显著促进了纤维化相关细胞因子的表达（IL-6、TGF-α/TGF-β1、CollagenⅠ/Ⅲ和MMP2/MMP9），加入30uM的JAK-STAT信号通路抑制剂AG490，则可显著降低CXCL6过表达诱导的纤维化相关细胞因子的表达。. 体外细胞实验表明，二黄颗粒可显著抑制高糖诱导的NRK-49F细胞增殖，且能抑制CXCL6及其受体CXCR1的表达，通过Elisa和Western blot检测发现，二黄颗粒可显著降低CollagenⅠ/Ⅲ、MMP2/MMP9、TGF-α/TGF-β1、STAT3的表达，CXCL6过表达后，加入50mg/ml的二黄颗粒溶液，可显著降低CollagenⅠ/Ⅲ、MMP2/MMP9、TGF-α/TGF-β1、STAT3的表达。在糖尿病肾病肾间质纤维化大鼠动物模型中，组化分析显示二黄颗粒显著改善肾组织纤维化；外周血生生化指标检测发现，二黄颗粒可显著改善模型大鼠血液中血糖、血清肌酐(Scr)、血清尿素氮(BUN)、尿酸(UA)和白蛋白(Alb)及尿液中尿蛋白的含量；Elisa检测发现，二黄颗粒显著抑制了纤维化相关因子的表达。qRT-PCR和Western blot 检测大鼠肾组织，发现二黄颗粒显著抑制CXCL6, CXCR1, MMP2, MMP9, Collagen Ⅰ, Collagen Ⅲ, PCNA和p-STAT的表达，并呈剂量依赖性。. 以上结果表明，二黄颗粒通过抑制CXCL6/JAK/STST3信号通路来改善糖尿病肾病纤维化。