基于核酸探针可控自组装的小RNA活体细胞成像分析

在本项目中，小RNA包括microRNA及小干扰RNA在活体细胞内生成的单链小RNA，其活体细胞成像分析对于microRNA生物功能的深入研究，重大疾病的早期诊断及基因治疗药物的开发都具有重大意义，也是目前尚待突破的瓶颈问题。本项目拟通过设计茎环结构的DNA探针，由小RNA引发DNA探针的一维、二维、三维可控自组装，形成以核酸杂交反应为动力的DNA纳米机器；建立多层次、多组分的可控自组装新方法。通过优化设计，揭示自组装过程的调控规律，建立高灵敏度生物兼容的识别与传感体系；形成在活体细胞生理条件下，无需任何酶催化的高灵敏度、高特异性分析检测小RNA的自组装新技术，并将其应用于小RNA活体细胞成像分析，突破小RNA分析中的瓶颈问题。通过发展以生物功能为导向的自组装体系，大大促进microRNA生物功能的深入研究及基因治疗药物的开发。

在本项目的资助下，以microRNA（miRNA）为模式目标分子，基于核酸探针的可控自组装，对小RNA的成像分析及均相溶液中小RNA高灵敏度检测进行了系统的研究。首先设计了针对miRNA目标分子的茎环结构DNA探针，该DNA探针与miRNA分子杂交，可以引发杂交链式反应（HCR）形成一维结构的双链DNA；该DNA进一步在氧化石墨烯（GO）表面自组装，可形成三维组装体系，并富集DNA探针标记的荧光基团，实现miRNA高灵敏度的荧光成像分析。同时，我们研究了磁性微球表面由miRNA引发的HCR，形成三维结构的自组装体系，可直接用于miRNA的荧光成像分析；也可以用流式细胞仪检测磁性微球表面的荧光，实现miRNA的灵敏检测。我们设计了两个茎环结构的DNA探针。miRNA与DNA探针杂交，形成以miRNA目标分子为催化剂的催化自组装体系，可应用于均相溶液中直接检测miRNA。以上自组装体系一般能灵敏地检测pmol/L ~ nmol/L的小RNA分子。. 为了进一步提高检测小RNA分子的灵敏度，我们设计了线性的两组（四个）DNA探针，miRNA与两个DNA探针杂交组装为有缺口的二维结构；利用连接酶将缺口连接生成一个新的DNA链，该DNA链作为模板连接另外两个DNA探针。这样，每一次连接形成的DNA链都可以作为下一轮连接DNA探针的模板，形成连接酶链式反应（LCR）的指数扩增体系。该扩增体系可检测低至0.2 fmol/L的miRNA分子，大大提高了检测灵敏度。针对不同的miRNA分子，对DNA探针进行长度编码，使不同的miRNA分子形成不同长度的LCR产物，经电泳分离，可同时检测多重miRNA分子。该扩增体系同时也应用于高灵敏度检测信使RNA（mRNA）及DNA甲基化。. 小RNA是mRNA翻译为蛋白质过程中重要的调控因子，蛋白激酶和磷酸化酶催化的蛋白质磷酸化和去磷酸化是翻译后的重要调控机制。基于磷酸化肽的自组装体系，我们研究了一系列高灵敏度的检测蛋白激酶和磷酸化酶活性的分析方法。