微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶的功能研究

Microsporidia are unicellular eukaryote microbes leading an obligatory intracellular parasitism in invertebrates and vertebrates. In several microsporidia genomes, the Subtilisin-like proteases (SLPs) were annotated, which often behaves as the virulence factor in the microorganisms, play an important role in the process of infection. However, SLPs functions are still unknown in microsporidia. Our recent work on Nosema bombycis(pathogen of silkworm pebrine) show NbSLP1 only localized to the apical of the germinated spore coat, suggesting that NbSLP1 may participate in spore germination through hydrolyze the spore wall protein to facilitate the polar tube extrusion. Based on the two genomes of pathogen(N. bombycis) and host(silkworm), Our proposal focus on the SLPs function study on three aspects as following: SLPs localization、substrate identification and the roles in germination and invasion, we try to elucidate the role of subtilisin-like protease in the infection process of microsporidia. As now no virulence factor of microsporidia was reported, our proposal is a original work. To carry out such a project is very helpful to discover the molecular mechanisms of germination process of microsporidia, which is a scientific question unresolved for more than one hundred years.

微孢子虫是一类广泛寄生于无脊椎动物和脊椎动物的真核微生物，营专性细胞内寄生。近年的研究发现，微孢子虫基因组中注释出类枯草杆菌蛋白酶（subtilisin-like protease, SLP)家族成员，而既有的研究已知SLP是一种在病原微生物感染过程中常见的毒力因子，但在微孢子虫中其功能尚不清楚。我们在研究家蚕微粒子病病原体- - 家蚕微孢子虫的SLP时发现：家蚕微孢子虫SLP1仅定位在发芽孢子顶端，推测其可能通过水解孢壁蛋白，参与促进孢子极丝弹出过程。基于我们已有的病原与宿主（家蚕）的两个基因组数据库和研究平台，本研究拟从微孢子虫SLP的亚细胞定位、作用靶标鉴定，以及其对微孢子虫发芽和侵染的影响三方面深入研究微孢子虫SLP的功能，以期阐明SLP在微孢子虫侵染中的作用。鉴于目前微孢子虫的毒力因子也未见报道，本研究是一项原创性很强的工作，对揭开微孢子虫侵染分子机制这一百年命题具有重要的价值。

类枯草杆菌蛋白酶（ subtilisin-like protease, SLP)是一种在病原微生物感染过程中常见的毒力因子，但在专性细胞内寄生的真核微生物微孢子虫中其功能并不清楚。微孢子虫中存在两类SLPs，SLP1具有前肽 和丝氨酸蛋白酶结构域，SLP2仅含有丝氨酸蛋白酶结构域和C端跨膜结构域。通过间接免疫荧光（IFA）、胶体金免疫电镜发现，NbSLP1的成熟酶位于孢子顶端固定盘处，并与极管蛋白PTP1的共定位显示，NbSLP1也分布在弹出的极管的末端，推测当孢子发芽时，该酶可能被激活成为成熟酶，水解固定盘相关蛋白，以利于孢子极丝的弹出。采用丝氨酸蛋白酶抑制剂 PMSF对家蚕微孢子虫孢子进行处理，发现PMSF可使孢子的发芽率降低20%，差异极显著；经 PMSF 处理的孢子添食家蚕后，可降低家蚕死亡率，差异显著，暗示家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶参与孢子的发芽过程并发挥重要作用。IFA显示NbSLP2分布于孢子内壁，NbSLP1 和NbSLP2二者的共定位荧光信号大部分不能重叠，推测家蚕微孢子虫两种类枯草杆菌蛋白酶NbSLP1和NbSLP2 在其入侵宿主的过程中可能扮演着不同的角色。互作蛋白研究方面，免疫共沉淀差异带经质谱鉴定结果显示，三磷酸甘油脱氢酶、翻译起始因子2C、ATP酶、内质网型ATP酶、孢壁蛋白1、假定孢壁蛋白7、热激蛋白 HSP70和极管蛋白2可能为 NbSLP1的互作蛋白，剪切位点位于 ATP 酶的两个结构域之间，推测 NbSLP1可能参与ATP 酶的加工成熟过程。利用生物信息学方法预测得到 NbSLP1底物BmTIR，NbSLP1的抗体可将 BmTIR 沉淀出来，复性的 rNbSLP1C 也可水解原核表达的rBmTIR。这些结果表明NbSLP1与BmTIR之间存在互作。如果NbSLP1能水解Toll受体，破坏其TIR结构域，Toll受体便不能把免疫识别信号传递至下游效应因子，从而减弱宿主家蚕的免疫防御，更有利于家蚕微孢子虫的寄生。免疫共沉淀和共定位显示，NbSLP2 与Nbseptin互作。但 NbSLP2 可能仅被septin环招募，是否是在环上行使功能还有待深入研究。 总之，本项目研究在探讨SLP功能方面具有原创性，取得了重要的科学研究发现，进一步丰富了现有微孢子虫侵染的分子机制。