家蚕微孢子虫孢壁蛋白质组及其在侵染中的作用研究

家蚕微孢子虫是家蚕微粒子病的病原，是专性细胞内寄生单细胞真核生物。其垂直经卵传播对养蚕业危害极大，被定为蚕业惟一法定检疫对象。研究表明，家蚕微孢子虫入侵宿主时，其孢壁蛋白参与对宿主的识别并在侵染中发挥重要作用，但其具体的分子功能尚不清楚。本研究小组在完成了家蚕微孢子虫7.8倍覆盖度全基因组测序工作基础上，成功地从家蚕微孢子虫孢壁中分离获得15种候选孢壁蛋白成分，这是迄今国际上在一种微孢子虫中发现的最多的候选孢壁蛋白，其中4种已通过免疫电镜定位。本项目基于家蚕微孢子虫（寄主）和家蚕（宿主）一对基因组数据平台，以已经开展的微孢子虫孢壁蛋白的研究为基础，对家蚕微孢子虫孢壁蛋白的时空表达特征、糖基化特点以及与宿主蛋白的互作进行系统地研究，并对部分孢壁蛋白的三维结构进行解析、分析它们在侵染中的作用、寻找与这些孢壁蛋白互作的家蚕靶蛋白，为阐明家蚕微孢子虫的侵染机制以及家蚕微粒子病的防治奠定坚实的基础。

家蚕微孢子虫是家蚕微粒子病的病原，对养蚕业危害极大，是世界养蚕国家唯一的检疫对象。一百余年来，其侵染宿主的机理仍未阐明。本项目以孢壁蛋白（SWPs）为靶标，围绕孢壁蛋白组成及其在侵染中的作用这一科学问题，进行了全面研究。项目执行至今，各项指标均已完成。现将重要成果摘要如下：1）鉴定了15个孢壁蛋白在孢子入侵宿主后的基因转录情况，大部分蛋白在感染前期（1-3天）即开始并持续转录。免疫电镜定位获得了13个孢壁蛋白的定位特征，其中7个定位在孢子外壁，2个定位在孢子内壁，2个在整个孢壁均有分布，还有2个分布于孢外壁和极管区。2）系统地研究了孢壁蛋白之间、孢壁蛋白-孢壁几丁质层之间的互作，首次绘制了微孢子虫孢壁蛋白组成架构图。酵母双杂交表明SWP1与SWP2、SWP3、SWP4、SWP5、SWP6存在相互作用，是孢壁组成的核心蛋白；SWP6与SWP1、SWP2和SWP3存在相互作用。证实SWP7和SWP9之间存在互作。SWP1、SWP2、SWP3、SWP7均能与孢壁几丁质层结合。3）SWP1鉴定为O-甘露糖型糖蛋白，是微孢子虫中第一个被证实的孢壁糖蛋白，发现其能介导孢子对宿主细胞的黏附。制备了SWP1单抗细胞株，并成功克隆单抗的编码基因，并将其转入家蚕细胞系，发现该细胞系可以成功表达并组装完整的单抗，并具有抗体活性。更重要的是，发现该细胞系对孢子的侵染增殖具有显著的抑制作用，暗示SWP1单抗可能干扰了孢壁组装进而影响了孢子的分裂增殖过程。4）SWP26 碳端具有一肝素结合基序，将该基序删除后，该蛋白即失去了与宿主细胞结合的能力。通过原核表达获得该蛋白晶体，三维结构解析发现其结构以α螺旋为主,肝素结合基序位于α7螺旋上，这是微孢子虫中第一个结构被解析的孢壁蛋白。5）SWP12是家蚕微孢子虫唯一具有BAR结构域的蛋白，双向电泳表明该蛋白具有磷酸化修饰的特征，发现其不仅具有与孢壁几丁质层结合的特性，而且具有BAR蛋白特有的脂质体成管活性。将其转入酵母中，能成功回复酵母BAR蛋白缺失造成的表型缺陷。6）SWP5在孢壁和极管上均存在，IFA和Pull down都证实了该蛋白与极管蛋白存在互作。7）发现枯草杆菌蛋白酶类似蛋白1（NbSLP1）在发芽前具有孢子两极定位的特征；极管弹出后，其荧光定位特征更引人注目，恰好定位于孢壁上的极管弹出位置，该蛋白可能是解开孢子发芽百年命题的关键蛋白。