猪带绦虫/囊尾蚴不同发育时期标识性抗原基因的筛选

The reported diagnosis antigen genes acquired by cDNA library of the previous studies were lake of the structural epitope and low expression levels which make the gene only transcription to mRNA without expression. absented the capture capability and the antibody arrest ability in immunity during parasites infection. And the absence impeded the genes application in clinical diagnosis, assay and vaccine study. On the basis of preliminary work, by using the phage peptide library triage technique and dielectrophoresis technology, the study will focus on the antigen genes of different developmental stages of Taeniasis/cysticercosis ,and filter the identification and protection epitope to overcome the absence. The isolated target antigen gene will be charactered through molecular, cell biology and immunology technology. The result of the study will successful contribute to vaccine exploit and clinical diagnosis of Taeniasis /cysticercosis. It will reveal antigen expression variance and molecular biology mechanism in different life phase of Taeniasis/cysticercosis, and it is also significant reference to study on immunity antigen of foodborn parasitosis in the species.

以往研究发现通过单一cDNA文库筛选寄生虫有效抗原基因，缺乏结构性功能表位和无法实现高表达等特性，使筛选基因过程处于mRNA转录水平。希望捕获标识性抗原基因对寄生虫实时产生的免疫抗体难以实现，致使对筛选所获得的抗原基因仍然停留在实验的初级研究阶段，实际应用于寄生虫病临床诊断和免疫预防分子的研制受阻。在前期工作基础之上，本研究拟以猪带绦虫/囊尾蚴为实验研究对象，采用噬菌体肽库筛选技术和双向电泳印迹筛选技术，对虫体不同发育时期抗原基因进行筛选，以期筛选出标识性和保护性强的靶标抗原；利用分子生物学、细胞及免疫学技术与方法鉴定期特异、高敏感及强保护性的抗原基因；为建立适用于人猪带绦虫/囊尾蚴病免疫学诊断和猪囊尾蚴病的临床检测的研究奠定基础，渴望揭示该虫体在不同的发育阶段抗原表达的消长变化规律及抗原在虫体感染过程中的作用机制。同时为类似的食源性寄生虫病，尤其是为寄生虫免疫性抗原的研究提供新的思路。

猪囊尾蚴病是一种重要人畜共患寄生虫病，已将其列为“17个被忽略的热带疾病之一”和“十大危害人类食源性寄生虫”，也是我国卫生部规划防治的重点寄生虫病之一。该病至今尚无有效诊断方法，特别是早期诊断，其根本原因在于缺乏对诊断抗原标识的挖掘。. 主要研究内容：（1）采集猪带绦虫/囊尾蚴阳性样品，实验室共分离到猪囊尾蚴虫体分离株，7株，囊虫病患者阳性血清13份，脑囊虫患者阳性脑脊液5份；肌肉囊虫阳性患者血清3份；椎管内囊虫阳性患者血清1份，椎管内囊虫患者脑脊液1份。（2）双向电泳免疫印迹技术选猪囊尾蚴囊液诊断候选抗原，实验未检测到蛋白质斑点。（3）Shotgun技术筛选猪囊尾蚴囊液候选诊断抗原，共获得486个蛋白组分，其中已鉴定蛋白为158种，未知蛋白328种，初步发现GP50、小热休克蛋白、8KDa糖蛋白和烯醇化酶为候选诊断特异性抗原。已知蛋白主要富集于PI3K-Akt和糖酵解/糖异生信号通路。PPI蛋白相互作用网络中的节点主要为糖代谢酶。（4）抗体芯片技术筛选囊尾蚴患者血清中候选诊断抗体，共筛选到271个候选抗体，挑选差异显著26个候选抗体进行验证研究。（5）Shotgun技术筛选的4个候选诊断抗原Western-blot结果显示，重组蛋白能被阳性血清识别；抗体芯片技术筛选的差异显著抗体26个，经ELISA验证结果为，均为阳性反应。（6）猪囊尾蚴全基因组DNA甲基化分析显示，发现在囊虫中有DNA甲基化的存在，结果中共发现mC位点21,077个，与其他物种不同的是除CpGs是主要的DNA甲基化类型外，DNA甲基化还普遍存在于CA、CT、CC连续位点，mCA甲基化占全部DNA甲基化mC的54%。转录组和DNA甲基组的整合分析表明，两个数据集之间存在很强的相关性，说明基因表达可能受到DNA甲基化的严格调控。. 本项目是国内外首次开展关于芯片技术筛选囊尾蚴患者血清抗体和甲基化方面的研究，有关成果将对免疫信号分析、虫体侵入和免疫逃避机制研究及宿主抗体变化规律研究提供理论参考。同时为本病的预防与控制提供科学依据，也为类似寄生虫的相关研究奠定基础。