我国旋毛虫属分类鉴定和分子进化研究

核糖体基因组是寄生虫保持物种不发生变异的重要细胞器。每个种属的旋毛虫核糖体基因组序列都存在一定的差异，这种差异是鉴定种属的标记分子。线粒体基因组在进化速度上是相对迅速的，它成为研究许多后生物种属进化相互关系的一种标记物。本课题拟通过调查我国旋毛虫病的流行盲区，以期捕获新属旋毛虫为目的。提取旋毛虫核糖体基因组和线粒体基因组，设计旋毛虫核糖体扩展片段V区引物和设计旋毛虫5S核糖体DNA基因间隔区引物，运用多重PCR方法鉴定种属特性。采用Illunina公司新一代Solexa高通量测序技术及其开发的序列比对ELAND算法和Bowtie算法，对旋毛虫线粒体基因组进行检测、分析和比较，以全面快速地获得种属进化关系。从而探究不同种属旋毛虫核糖体和线粒体基因组序列的异同点，可望寻找到优秀的抗原基因，为建立高效、特异的免疫学诊断和疫苗的研发奠定基础。

旋毛虫（Trichinella）现已确定9个种和3个分类不明的基因型，该虫体分布地域广泛，能感染150多种动物。前期研究我国流行种为T. spiralis（T1）和T. nativa（T2），迄今为止尚未发现新种流行。不同地区旋毛虫分离株核糖体DNA序列存在一定差异，这种差异是旋毛虫感染过程中适应不同生存环境进化的结果，其序列也是种属鉴定的标记分子。旋毛虫线粒体基因组DNA序列决定种属进化重要标记物。虽然12个种的线粒体基因组均在GenBank注册，但我国不同地区种内线粒体基因组比较研究尚未涉及。. 项目实施和完成的主要内容：（1）利用ELISA和常规法对我国部分地区进行流行病学调查，并获取不同地区旋毛虫已达34株（传代丢失1株）。（2）设计特异性PCR引物，分别扩增10个不同地区旋毛虫分离株核糖体扩展片段V区、5S核糖体DNA基因间隔区、线粒体核糖体小亚基和大亚基DNA基因片段，鉴定旋毛虫分离株的种类。结果显示，7个猪源分离株为T. spiralis（T1）种，2个犬源分离株为T. nativa（T2），10个不同地区旋毛虫分离株与T. spiralis（T1）或T. nativa（T2）具有较近的亲缘关系， 1个犬源分离株（Trichinella sp--Ts7）分离株为T1和T2杂合种。（3）通过对12个旋毛虫种线粒体基因组DNA的进化分析表明，不同种间线粒体基因组存在一定差异，T1与T7、T2与T6亲缘关系较近。 . 扩展研究内容与结果：（1）旋毛虫四个种（T1、T3、T6、T7）RRBS甲基化研究表明，不同种间存在不同的甲基化，种间甲基化修饰水平存在明显的差异，T1与T7差异明显。（2）利用具有遗传多态性的微卫星序列对旋毛虫进行种内及种间鉴定。结果显示，在12个虫种中都能扩增出目的片段的微卫星序列共9个，其它微卫星序列在6个以上虫种中能扩增出目的片段，表明微卫星位点在不同虫种间较为保守。.本项目是国内外首次开展关于甲基化和微卫星位点对旋毛虫种属鉴定的研究，有关成果将是未来深入开展旋毛虫分子进化、分子免疫、虫体遗传规律及遗传多态性研究提供理论参考。同时为本病的预防与控制提供科学依据，也为类似寄生虫的相关研究奠定基础。