猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）结构蛋白T细胞表位图谱的绘制

The charactitics that porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV） had the antibody-dependent enhancement and the antigens of PRRSV were easily variable made it difficult to explore the effective PRRSV vaccine and to control PRRSV，so PRRSV made the huge economic loss for the swine industry.Many previous studies have shown that the cellular immune response may play an immportant role in controlling PRRSV, and most of all PRRSV structural proteins could induce the cellular immune response. However, as so far, there is no report about the T cell epitopes of PRRSV GP2a、GP2b、GP3 and GP5a, and the prediction method by previous report may miss some T cell epitopes of GP4 and N proteins. So the aims of present project were to screen and to identify T cell epitopes of PRRSV GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5a和N proteins by overlapping peptide methods and the IFN-γ ELISPOT assay，and then to draw the T cell epitope mapping of PRRSV structural proteins by adding additonal T cell epitopes of GP5 and M which have been reported. The implementation of the project will afford basis for studying the mechanism of cellular immunity of PRRSV and will be significant for futher exploring universal and noval PRRSV vaccine and for effectively controlling and preventing PRRSV.

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的抗体依赖增强作用和抗原易变特性给PRRSV的疫苗研究和疫病控制带来了重重困难，给养猪业造成的损失巨大。大量研究表明，细胞免疫可能在PRRSV免疫保护中起到重要的作用，PRRSV所有的结构蛋白基本上都能诱发机体的细胞免疫反应。迄今为止，有关GP2a、GP2b、GP3和GP5a的T细胞表位还未见报道，而已报道的预测法鉴定的GP4和N蛋白的T细胞表位可能存在疏漏。因此，本项目拟通过重叠多肽法和IFN-γ酶联免疫斑点试验（ELISPOT）筛选法鉴定PRRSV GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5a和N蛋白的T细胞表位，并结合已报道的用重叠多肽法鉴定的GP5和M蛋白的T细胞表位，绘制PRRSV 结构蛋白的T细胞表位图谱。项目的实施将为研究PRRSV细胞免疫机制打下基础，对进一步研发PRRSV通用新型疫苗，有效防控PRRSV具有重要意义。

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起免疫抑制，并缺乏有效的疫苗。大量研究表明，宿主细胞免疫可能在抑制PRRSV中起重要的作用。本项目以高致病PRRSV疫苗株JXA1-R为病原，以肌肉注射的方式感染5头PRRSV抗体阴性试验猪，而对照组以细胞破碎后上清液为免疫原，同样以肌肉注射的方式注射3头PRRSV抗体阴性试验猪。免疫后每周对试验猪采血，分离血清样品。免疫12周后，大量采血，分离外周血单个核细胞（PBMC）。经PRRSV抗体检测试纸检测，试验组动物在感染3周后血清中就能检测到PRRSV特异性抗体。而间接ELISA测定，试验组猪在感染第4周开始出现PRRSV结构蛋白抗体，第8~9周抗体水平达到峰值并趋于平稳。然后将PRRSV的GP2、GP2b、GP3、GP4、GP5a按照9氨基酸重叠法设计并成功合成长度为18个氨基酸的重叠多肽，而PRRSV GP5、M和N蛋白按文献已报道的T细胞表位合成相同或与JXA1-R病毒相关蛋白序列一致的多肽，然后将这些肽段作为刺激剂，加入到分离的猪PBMC， ELISPOT检测猪PBMC所分泌的IFN-γ，记录斑点数，若斑点数大于等于阳性判定临界值，则为阳性多肽。结果显示：GP2含有6个T细胞表位，GP2b含有2个T细胞表位；GP3 含有3个T细胞表位；GP4含有6条T细胞表位； GP5a含有1个T细胞表位；GP5含有1个T细胞表位；M含有8个T细胞表位；而N蛋白含有2个T细胞表位。同时，本项目围绕PRRSV抑制先天性免疫这一核心科学问题，发现PRRSV上调的miRNA-373通过靶向I型干扰素转录信号蛋白IRAK1、IRAK4、IRF1以及NFIA和NFIB而抑制I型干扰素的转录，发现PRRSV通过非结构蛋白nsp11和nsp1α抑制NLRP3介导的炎症反应，并发现PRRSV通过调控AGO-2而抑制RNAi先天免疫免疫系统。本项目的实施，为开发基于T细胞表位的PRRSV疫苗提供了理论基础，为全面了解PRRSV的免疫抑制特点提供了有力证据，因此本项目的实施有利于PRRSV防控。另外，项目执行期间共发表SCI论文8篇，培养博士研究生2名，硕士研究生4名。