建立一种能实时直观评价丙型肝炎病毒抑制剂作用效果的新型实验动物模型

由于缺乏稳定可靠的丙型肝炎病毒（HCV）感染小动物实验模型，极大阻碍了抗HCV药物的筛选与评价。本课题拟建立一种可在重症免疫缺陷（SCID）小鼠体内复制HCV的新型实验动物模型，主要用于抗HCV抑制剂的快速检测。为此首先要构建含有荧光素酶基因、新霉素抗性基因和细胞培养适应性突变位点的HCV全长基因组质粒，体外转录制备RNA，转染肝癌细胞株Huh7.5，经体内、体外双重筛选和重复回注SCID小鼠再筛选，获得能长期稳定传代、肿瘤生长速度最快和荧光发光强度最大的细胞克隆；然后接种小鼠，一定时间后注射抗HCV抑制剂，通过小动物在体成像系统测定并直观显示用药前后小鼠体内荧光强度的改变，评价该新型小鼠模型作为抗HCV药物筛选动物模型的稳定性和有效性，并制定评价标准。该系统的特点是能够快速全面分析针对HCV不同靶位的抗病毒药物单独或联合用药后的作用效果，进而可用于抗HCV药物体内作用的药效药理学评价。

丙型肝炎病毒（HCV）是丙型肝炎的病原体，HCV感染后，约50~85%感染者发展为慢性肝炎，其中20~30%的慢性肝炎发展为肝硬化，部分发展为肝细胞癌，危害严重。然而由于缺乏稳定可靠的细胞培养模型与小动物模型，极大阻碍了抗HCV感染研究的深入开展。本课题在前期确定的细胞培养适应性突变位点和小动物成像研究的的基础上，建立了一种可在重症免疫缺陷（SCID）小鼠体内复制的HCV实验动物模型，为抗病毒药物的快速筛选和药效评价奠定了基础。主要结果如下：.首先构建了含有HCV 5’UTR、luc报告基因、泛素切割位点、neo抗性基因、EMCV( 脑心肌炎病毒)的IRES、HCV结构蛋白编码基因、非结构蛋白编码基因与3’UTR的HCV全长cDNA克隆入真核表达载体，并置于T7启动子下游。然后制备了上述重组真核表达载体的体外转录感染性RNA并转染Huh7.5细胞，酶切使载体呈线性，转录后Trizol法提取转录产物，得到了带有外源基因的HCV全长RNA，使用电转化法转染Huh7.5细胞，经G418筛选，获得了稳定转染的细胞克隆。RT-PCR检测转染细胞中HCV RNA和间接免疫荧光检测转染细胞中的HCV蛋白的表达，结果均呈阳性，可看到明亮的荧光，说明转染成功，有蛋白表达。然后把转染细胞分别皮下注射于四只SCID小鼠腹腔，等待肿瘤生长后，采取肿瘤团块，捣碎后分别回注小鼠，在接种的四只SCID小鼠中，其肿瘤生长速度相差不大。接着收集上述四只小鼠的肿瘤细胞，处理和吹打分散后进行体外培养，取其对数生长期细胞转染重组的HCV RNA，并用G418筛选，筛选后加入细胞裂解液，离心后取上清加显色底物荧光素，用成像仪测定细胞发光强度，结果在四只小鼠选择的肿瘤细胞中，其中1只小鼠的肿瘤细胞再转染HCV RNA后的发光量最高，由此筛选出了荧光素发光量最高的肿瘤细胞。最后把上述荧光素发光量最高的肿瘤细胞注射入SCID小鼠体内，待肿瘤生长后，用小动物活体光学成像仪检测并记录反应产生的光子，以ROL光子数代表luc的表达强度，结果在小鼠体内肝脏部位均可以检测到明亮的荧光，说明小鼠模型制备成功。该小鼠模型可针对HCV的一个靶位或一种酶单独用药评价，也可针对HCV的多个靶位或多种酶联合用药评价，为进一步深入研究奠定了坚实的基础。