酪氨酸磷酸化修饰调控Nrf2出核转运的机制及其在内毒素肺损伤中的作用

内毒素肺损伤发病机制复杂，目前缺乏有效的治疗措施。Nrf2是内源性抗损伤系统的关键转录因子，在肺组织抗损伤中具有重要作用，酪氨酸激酶Fyn是调控Nrf2出核转运的重要激酶，在内毒素肺损伤中具有重要作用，我们前期研究发现高浓度TNFα和过氧化氢导致肺微血管内皮细胞Nrf2转录活性降低。因此本课题在前期研究的基础上提出"Fyn →Nrf2 Try568磷酸化→Nrf2-sMaf解聚→Nrf2转运出核→内源性抗损伤能力降低"是内毒素肺损伤发生的另一重要机制。通过建立大鼠LPS肺损伤模型和培养PMVECs，应用FRET、免疫荧光、定量PCR、EMSA、基因克隆、定点突变等技术研究Nrf2-sMaf蛋白解聚在酪氨酸磷酸化修饰后Nrf2出核转运和内毒素肺损伤中的作用，为从内源性抗损伤途径干预ALI提供新思路和治疗靶点。

急性肺损伤（acute lung injury, ALI）是临床常见的危急重症，进一步可发展成为急性呼吸窘迫综合征，尽管对ALI病因、发病机制的理解越来越深入，然而目前临床仅有保护性机械通气可降低其死亡率，而且死亡率居高不下。本项目在前期研究发现内源性保护机制动员不足是ALI发生发展的另一重要机制的基础上，以转录因子Nrf2为核心，研究Nrf2出核转运增加引起Nrf2转录活性降低、内源性保护机制动员不足在ALI发生发展中的作用。本项目通过在体和细胞实验，采用免疫荧光、EMSA、western blotting、基因克隆和定点突变等技术研究发现：①ALI时，Nrf2转录活性降低，酪氨酸激酶Fyn活化；采用特异性酪氨酸激酶阻断剂pp2处理可阻断Fyn磷酸化和Nrf2出核转运，并明显减轻肺损伤程度；②与小剂量LPS处理比较，大剂量LPS可引起细胞核内Nrf2含量降低，采用pp2或出核转运体CRM1抑制剂LMB可增加细胞核内Nrf2含量；③大剂量LPS可引起酪氨酸激酶Fyn磷酸化，pp2可抑制大剂量LPS诱导的Fyn磷酸化、阻断Nrf2出核转运；④将568位酪氨酸突变为苯丙氨酸后，大剂量LPS不会引起细胞核内Nrf2含量下降；说明大剂量LPS通过催化Fyn磷酸化修饰，活化的Fyn通过催化第568位酪氨酸磷酸化修饰，进而通过出核转运体CRM1介导Nrf2出核转运；⑤短暂低温处理可通过增强Nrf2的转录活性，增强内源性抗氧化和抗炎症反应能力，从而减轻肺损伤程度；⑥外源性硫化氢供体可通过增强Nrf2转录活性减轻肺损伤。上述研究结果证实了以Nrf2为转录调节核心的内源性保护系统动员不足在ALI发生发展中具有重要作用，增强Nrf2转录活性可通过增加内源性抗氧化和抗炎症反应能力，达到有效减轻肺损伤的作用。本研究结果为从增强内源性保护能力的角度为ALI的临床治疗提供了新的思路。