极端嗜热木聚糖酶在黑曲霉系统中的高效分泌表达研究及其机理研究

本研究在已实现细菌极端嗜热木聚糖酶XynB在黑曲霉中分泌表达的基础上，通过构建黑曲霉glaA融合表达和非融合表达系统，比较两种表达策略产生的XynB的mRNA量及其酶学性质的差异，分析不同表达方式对于重组蛋白的影响；比较UPR系统中hacA和分子伴侣bipA在不同表达策略中的表达量变化，揭示外源蛋白分泌对黑曲霉UPR调控系统的影响；比较内源glaA的表达水平，分析glaA融合表达xynB对于内源glaA的干扰现象。通过RNAi技术沉默黑曲霉内源α-amylase基因的表达，使α-Amylase蛋白分泌量降低，以期提高外源XynB的分泌量。本研究利用基因工程技术达到充分发掘黑曲霉高分泌能力的目的，建成分泌量更高的黑曲霉工程菌用于工业生产；以结构稳定的嗜热xynB基因为报告基因，研究黑曲霉UPR系统的调控特点，是本研究的一个创新之处，可为深入研究黑曲霉蛋白分泌调控积累信息。

本研究以黑曲霉为表达宿主，利用黑曲霉内源的葡萄糖淀粉酶基因（glucoamylase/glaA）的启动子，信号肽，原肽序列表达极端耐热细菌Thermotoga maritima的木聚糖酶B基因（xynB）。并且通过构建融合型表达载体（glaA的前489个氨基酸与XynB形成融合蛋白，在分泌后期，XynB可以从融合蛋白中分离）与非融合型表达载体进行比较研究，发现非融合表达分泌的XynB普遍多于融合表达的XynB， 通过实时定量PCR证实非融合表达的xynB的mRNA也多于融合表达的xynB，并且发现融合表达的菌株的UPR（Unfolded protein response）系统被激活。UPR的激活可能导致的融合系统中内源glaA的表达下调。以表达水平最高的非融合表达菌株为对象，进行发酵温度的优化，在30-40度范围内，35度为最优的产酶发酵温度。本研究利用基因工程、分子生物学和发酵工程技术达到发掘黑曲霉高分泌能力的目的，并建成分泌量更高的黑曲霉工程菌用于工业生产，可为深入研究黑曲霉蛋白分泌调控积累信息。