羧甲基壳聚糖对雪旺细胞的促增殖作用及调节机制

Many researchers have reported that Schwann cells（SCs） could be a promising method for the repair of spinal cord injury (SCI) and peripheral nerves injury. In our previous study, SCs were treated by the carboxymethylated chitosan (CMCS), the results indicated that CMCS could promote the SCs proliferation and NGF secretion, while found that the MEK/ERK, PI3K/Akt and Wnt/β-catenin signaling cascades were take the important roles in CMCS stimulated SCs proliferation and secretion of NGF. In this study, we will explore the cell cycle and apoptosis of SCs, and the molecular mechanism of SCs proliferation stimulated by CMCS, especially the roles of PKA, PKC and NF-κB signaling cascades in CMCS treated proliferation and secretion of SCs will be investigated. The main purpose of this study is to lay the foundation for the further use of the CMCS activated SCs in the rehabilitation of SCI and peripheral nerves injury.

通过组织工程技术运用雪旺细胞修复损伤脊髓与周围神经是目前颇具前景的方法。在先前的研究中我们发现羧甲基壳聚糖对体外培养雪旺细胞增殖及NGF分泌具有促进作用，且MEK/ERK、PI3K/Akt及Wnt/β-catenin信号通路在该效应中起重要作用。本研究中，我们将进一步观察羧甲基壳聚糖对体外培养雪旺细胞细胞周期进程、细胞周期蛋白表达、细胞凋亡及神经营养因子分泌的影响；并检测羧甲基壳聚糖对雪旺细胞内PKA、PKC及NF-κB信号转导通路激活的影响，及上述信号通路在羧甲基壳聚糖促雪旺细胞增殖与分泌中的作用进行研究，并研究其可能作用机制。本课题的实施可为羧甲基壳聚糖激活雪旺细胞在脊髓及周围神经损伤修复的研究与临床应用奠定一定的理论与实验基础。

前期研究初步证实CMCS可以促进SCs增殖，本课题旨在运用生物信息学、蛋白质生物化学、细胞生物学等方法与技术进一步探讨并证实CMCS对SCs的增殖促进作用及氧化应激诱导凋亡的保护作用，并对信号通路PKA、PKC、NF-κB、线粒体途径参与上述效应的机制进行初步研究。本课题首先通过体外分离大鼠坐骨神经、培养并纯化SCs，S-100免疫荧光染色鉴定SCs。通过不同浓度CMCS作用SCs，应用MTT、CCK-8及BrdU染色法检测CMCS对SCs增殖的影响，结果证实了CMCS对SCs的促增殖作用。荧光定量PCR及蛋白质生化检测证实CMCS可促进SCs内神经营养因子NGF及CNTF的表达。H2O2诱导构建SCs凋亡模型并加入CMCS共培养，通过流式细胞技术及Hoechst33342染色检测凋亡情况，结果表明CMCS可抑制H2O2诱导SCs凋亡，并发现CMCS通过抑制线粒体凋亡途径发挥上述效应。另外本研究还证实CMCS可增加SCs内cAMP含量、增强PKA活性、增加CREB表达、激活p65/NF-κB。本课题应用信号通路抑制剂H-89、Staurosporine及PDTC分别阻断PKA、PKC及NF-κB通路，进一步阐明上述通路在CMCS促SCs增殖效应中的机制。综上所述，本课题证实了CMCS具有调节SCs增殖分泌及保护SCs凋亡的生物学效应，同时为CMCS应用于周围神经再生提供了重要的理论与实验依据。.本课题共发表论文12篇，其中SCI论文4篇，中华级论文3篇，统计源核心期刊论文5篇；课题实施期间培养博士研究生1名，硕士研究生1名（目前为在读博士）；项目投入经费23万元，支出21.15万元，各项支出基本与预算相符。剩余经费1.85万元，剩余经费计划用于本项目研究后续支出。