调控沉默基因及突触激活的miRNA在耐药性癫痫形成中的作用

神经元异常网络的形成可改变癫痫放电传播的方向，避开内源性抗癫痫系统对其的抑制和传统抗癫痫药物作用的位点，导致耐药性癫痫的产生。而沉默基因和突触的激活使许多在生理条件下没有或仅有间接联系的基因或蛋白联系在一起是神经元异常网络形成的关键。课题组拟在前期用基因芯片、蛋白芯片、质谱、关联分析结合神经电生理学、表观遗传学和影像学等手段证明有20多种基因和蛋白参与了耐药性癫痫神经元异常网络形成及由hsa-mir-200c调控的STRN、KCN、ADCY2基因表达有异常的基础上，利用已建立起来的耐药性癫痫患者术后脑组织库（有200多例标本）和癫痫资源库（收集有254个癫痫家系，有7300多患者定期随访），用miRNA芯片和相关技术研究miR-29、miR-132、miR-134、miR-138、miR379-410等miRNA的表达，探索其在耐药性癫痫异常网络形成中的作用。

1.主要研究工作：. 1)建立了由300多例耐药性癫痫患者手术后脑组织组成的脑库，采集了200多例耐药和非耐药癫痫患者的血液和脑脊液，成功建立了氯化锂-匹鲁卡品点燃，戊士氮点燃、海仁酸点燃和杏仁核电点燃动物模型；2)利用microRNA芯片对耐药性癫痫患者和对照组颞叶脑组织中进行了差异表达microRNA的筛选，并应用生物信息学技术对上述实验筛选出来的差异表达基因进行了分析;3)采用荧光定量PCR技术对差异表达的miRNA进行扩大样本量验证，同步采用双荧光素酶报告系统对其可能的作用靶点进行了预测和验证；4)将上述差异表达的microRNA，根据不同的特征采用病毒转染、基因沉默、过表达等方法分别在四种动物模型中进行了靶基因对癫痫发作潜伏期、发作强度、发作持续时间、点燃率、首次自发性发作的时间、脑电图上痫样放电等动物行为学和电生理影响的研究；5)用免疫荧光、免疫组化影响，蛋白印迹、PCR等方法观察了差异表达基因及其预测靶基因在四种癫痫动物模型和200多例耐药性癫痫患者脑组织中的表达及其规律；6)利用膜片钳、病毒转染、基因沉默、过表达等技术研究了差异表达microRNA影响癫痫发作的可能机制及其靶基因的变化规律。.2.主要发现：. 1)发现耐药性癫痫患者脑组织中有206种差异表达的microRNA，其中13种可能有潜在的生物学意义，miR-124、miR-9、miR-137等6种对癫痫动物的行为学及电生理活动有明显影响；2)发现miR-124、miR-9、miR-137分别对其靶基因CREB1、IGF-1、CDC42有重要的调节作用，其参与了癫痫的发生与发展;3)初步揭示了上述6种microRNA及其相关基因参与癫痫发生与发展的可能机制，并有可能成为潜在的新型抗癫痫药作用的靶点，为癫痫的防治提出了一条新的途径；4)发现 Neural Cell Adhesion Molecule ，Growth Factor在耐药性癫痫患者脑脊液、血液中存在差异表达，这些靶基因及相关蛋白有可能成为耐药性癫痫患者潜在的生物标记物。.3.取得的阶段性成果：研究中先后发表科研论文21篇，其中18篇被SCI收录（最高IF=6.8），主编出版学术专著1部，参编1部（英文），提出了环境因素可能在癫痫的发生发展中起着重要作用的假说（论文正在撰写中），培养博士8名，硕士10名。