靶向Frizzled7抗体融合蛋白的设计及其增强NKG2D途径免疫监视功能的研究

Triple negative breast cancer (TNBC) is one of the most difficult malignancy to treat due to a lack of targeted therapy. Studies have demonstrated that activation of Wnt/β-catenin signaling is preferentially found in TNBC. It was recently discovered that Fzd7 (receptor of Wnt) was up-regulated in TNBC and TNBC-derived cell lines, and that Fzd7 modulated TNBC tumorigenesis through the canonical Wnt signaling pathway. Here, we intend to obtain an anti-Fzd7 scFv through the phage display technology, and propose a design of a novel antibody fusion protein (anti-Fzd7-MICA) which consists of an anti-Fzd7 scFv and MICA. NKG2D-mediated recognition of malignant cells by cytotoxic lymphocytes is enabled through MICA (activating NKG2D receptor). We postulate that the particular antibody fusion protein will target the tumor tissue precisely to block the Wnt pathway via scFv section, further recruit and active the NK cells through MICA-NKG2D pathway to strengthen the immunosurveillance. On the basis of the construction and expression of anti-Fzd7-MICA, we will monitor the kinetic process of the fusion to Fzd7/NKG2D and verify the targeting effect in vivo. The antineoplastic activity and mechanism of the fusion will be studied through a series of experiments in vitro and in vivo, and the immunoregulatory activity of MICA section will be highlighted by comparison with anti-Fzd7 scFv. The novel design hopes to provide a safe and effective candidate for the clinical treatment of TNBC.

三阴性乳腺癌（TNBC）是恶性程度很高的肿瘤且缺乏有效的靶向治疗手段。研究表明，TNBC中频繁发生Wnt通路的异常活化，Wnt受体之一Fzd7在TNBC中显著上调，并通过经典Wnt通路调节肿瘤的发生发展。本项目拟用噬菌体展示技术获得抗Fzd7的单链抗体，并提出一种抗Fzd7 scFv与MICA融合分子的设计。机体免疫监视作用的重要机制是NK细胞借NKG2D与肿瘤细胞表面MICA作用而发挥杀伤效应。该设计既可通过scFv部分精准靶向肿瘤组织，又可通过抗体融合的MICA经MICA-NKG2D途径招募、活化NK细胞，强化机体的免疫监视作用。基于此融合抗体的构建表达，我们监测其与Fzd7/NKG2D作用的动力学过程并验证其体内靶向性；研究其抗肿瘤活性及机制，并通过对比scFv突出MICA部分的免疫调节活性。望通过本设计为TNBC的临床治疗提供安全有效的候选方案。

TNBC的ER、PR、HER2表达均为阴性，不能进行有效的靶向治疗。常规化疗的预后极差，且死亡率高，为TNBC寻找潜在有效的治疗靶点势在必行。Wnt信号通路在TNBC发生发展中发挥重要作用，Fzd7蛋白是Wnt的关键受体之一，丰度表达于TNBC细胞表面，靶向Fzd7抗体的开发具有良好的前景。临床发现大多数上皮肿瘤患者肿瘤组织中MICA蛋白表达都为阳性，暗示在这类患者体内存在MICA-NKG2D受体系统功能性妥协，允许肿瘤细胞在MICA表达阳性的基础上增殖。研究发现血清可溶性MICA水平的显著升高，导致了NK细胞的功能缺陷，并进一步指出可溶性MICA由肿瘤细胞表面MICA的脱落产生，发生免疫逃逸。经文献调研发现，在上述大多MICA呈阳性的上皮性肿瘤细胞（包括TNBC）中均存在Fzd7高表达，故推测抗Fzd7的抗体可能作为有效的载体连接MICA蛋白，激活NKG2D途径，恢复NK细胞的免疫监视作用。本研究通过杂交瘤技术和人源化设计获得了高纯度、高亲和力的抗Fzd7抗体SHH002-hu1，亲和力常数KD<1×10-12 mol·L-1。通过一系列体内外实验验证了SHH002-hu1可通过阻断Wnt/β-catenin信号通路抑制TNBC的生长，且有潜力通过阻断Wnt信号通路增强Bevacizumab的抗肿瘤效果，有效降低抗血管生成药物治疗后TNBC复发及转移的风险，Bevacizumab与SHH002-hu1联合用药为TNBC的临床治疗提供了有效的候选方案。接下来本项目以对肿瘤免疫监视系统的激活为目标，设计并表达了一种靶向Fzd7抗体和MICA蛋白融合的蛋白SHH002-hu1-MICA，经验证其保留了母体单抗与rhFzd7的高亲和力（KD<1×10-12 mol·L-1），也可与rhNKG2D有效结合（KD=4.52 × 10-8 mol·L-1），并且MICA半分子的融入可以增强SHH002-hu1介导的NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒作用。此设计首次将靶向Fzd7治疗和免疫激活相结合，为相关研究中的一次创新，一方面能通过Fzd7的抗体特异性阻断Wnt信号通路，精准靶向肿瘤病灶；另一方面能有效激活机体自身免疫功能，重建NKG2D途径的免疫监视功能，为TNBC提供有效的临床治疗候选方案。同时，自主知识产权的新型融合抗体的开发，为抗肿瘤抗体的临床应用提供一种新的设计思路。