LPS-TLR4介导自噬发生的关键调控分子的确认及调控机制研究

LPS在脓毒症发生中具有重要作用，其介导的TRAM-TRIF依赖信号转导途径不仅与细胞活化有关，而且与细胞自噬密切相关。本课题组前期发现"氯喹可抑制LPS介导的TRAM-TRIF依赖信号转导途径导致的细胞活化，但不可思议的是，它尚可导致LPS和其受体TLR4共区域化消失"的现象；据此，我们提出"作为自噬特异性抑制剂的氯喹，抑制了细胞的自噬，此时在自噬过程中发挥重要作用的"某物质"被激活或表达上调，在碱性环境下将LPS和TLR4复合物解离并解除共区域化，以保证细胞内环境的稳定"的假说。为证实此假说，本项目拟采用差异蛋白质组学方法寻找该蛋白，通过数据库比对或克隆表达该蛋白结合同源模建的方法确定蛋白的结构和特性；利用siRNA干扰该蛋白的表达，观察LPS和TLR4分离、细胞自噬和细胞活化状态的改变。为阐明该蛋白质在LPS介导自噬发生中的调控作用、脓毒症发生的病理生理机制、药物研究新靶点奠定基础。

LPS/TLR4信号转导通路的活化是导致过度炎症反应、引发脓毒症的关键环节，研究其调控机制具有重要意义。本课题组前期发现“氯喹可抑制 LPS 介导的TRAM-TRIF 依赖信号转导途径导致的细胞活化，并可导致 LPS和其受体TLR4 共区域化消失”的现象，据此我们提出“作为自噬特异性抑制剂的氯喹，抑制了细胞的自噬，而激活或表达上调“某物质”以保证细胞内环境的稳定”的假说。为证实该假说，本项目首先采用差异蛋白组学方法（iTRAQ）寻找氯喹预处理抑制LPS介导巨噬细胞的差异表达蛋白，经定量PCR和Westrn Blot分析法验证确认进一步研究的蛋白分子；之后采用siRNA干扰或过表达的方法调节该蛋白的表达，观察对LPS-TLR4复合物的分离和胞内定位及其介导巨噬细胞活化的影响。研究结果显示：1）氯喹可减少小鼠巨噬细胞胞膜表面TLR4分布，增加其在早期内体和晚期内体的分布，提示氯喹抑制LPS介导的LPS-TLR4复合物的“共区域化”消失可能与其对内体循环的调节有关。进一步研究显示，氯喹可显著上调内体循环关键调控蛋白分子Rab5和Rab7的表达。采用siRNA转染的方法干扰Rab5和Rab7的转录表达后，氯喹介导LPS-TLR4复合物“共区域化”消失以及对巨噬细胞炎性活化的抑制作用被显著逆转。2）氯喹能够剂量依赖性负调控以SENP6为靶标的microRNA—miR-669n的表达水平，进而消减miR-669n对SENP6蛋白表达的抑制水平，导致对NF-κB的抑制活性增加，影响LPS刺激所致的巨噬细胞炎性活化。在小鼠过表达或干扰表达miR-669n，可显著降低外周血炎症介质水平，提高LPS攻击模型小鼠的存活率。上述结果提示，氯喹可能通过抑制miR-669n的表达，进而增加SENP6 蛋白的水平，从而发挥抗炎效应。3）氯喹还可具有下调炎症小体活性的作用，进而发挥对巨噬细胞活化的抑制作用。上述作用的具体分子机制与氯喹抑制炎症小体复合物形成中的关键调控蛋白NLRP3的转录表达有关。以上研究结果表明，氯喹对LPS-TLR4信号通路多个环节均具有调控活性，能够通过影响内体循环，介导LPS-TLR4复合物的“共区域化”消失，从而导致炎症信号消失。氯喹也可通过干预NF-κB信号通路中重要抑制因子的miRNA调节机制，或通过影响炎症小体的形成，抑制LPS介导的细胞活化，维持细胞内环境稳态。