LPS拮抗剂苦柯胺B介导LPS在肝脏内化清除的分子机制研究

Bacteria induced sepsis contributes mainly to incidence of death in clinics. Lipopolysaccharide (LPS) is the major pathogenic factor for sepsis. Therefore, it is of vital importance to study the clearance and degradation of LPS. The intake and clearance of LPS in liver could be performed in the form of free LPS or conjugated with endogenous proteins. We found in our previous work that kukoamine B, a plant derived LPS antagonist, could increase survival of sepsis model animal via directly binding and neutralizing LPS. We also found that LPS was still cleared in liver when conjugated with KB. Considering the fact that the routine binding sites of LPS by receptors has been blocked and there exists no receptors for KB in liver, we believe it is essential to study and identify the intake and clearance of LPS combined with exogenous molecules. In this study, we will first determine the cell type in liver that contributes mainly to the intake of KB-LPS complex. Then we will investigate the receptors and enzymes involved in the uptake and degradation of the complex, in order to elucidate the mechanisms of intake and clearance of LPS combined with exogenous molecules, which provides evidences supporting the discovery of novel drug target associated to LPS clearance.

细菌脓毒症是临床病人死亡的主要原因之一，LPS是脓毒症的主要致病因子，研究其清除、降解机制具有重要意义。LPS能够以游离型或与内源性蛋白结合的结合型方式在肝脏被相应的受体摄入、降解而得到清除。本项目前期发现外源性小分子化合物苦柯胺B（KB）能够通过与LPS直接结合而发挥中和LPS的作用，从而显著提高脓毒症模型动物的生存率；还发现与KB结合的LPS可被肝脏摄入、清除。由于LPS被受体识别的结构部位已被KB封闭，机体肝脏细胞又不存在识别KB的受体，因此研究与外源性物质结合的LPS的降解和清除途径具有重要意义。因此，本项目首先采用体内外实验明确肝脏摄取KB-LPS复合物的细胞类型，再明确细胞摄取LPS的具体方式以及代谢酶，为阐明与外源性物质结合的LPS的降解和清除途径、获得新的药物靶点奠定基础。

LPS 是脓毒症的主要致病因子，研究其清除、降解机制具有重要意义。苦柯胺B（kukoamine B，KB）是课题组自主研发的抗脓毒症1.1类新药。该化合物可与LPS直接结合而发挥中和LPS和防治脓毒症的作用。本项目前期发现与KB结合的LPS已被封闭，但仍可被肝脏摄入、清除，而具体机制不明。因此本项目首先采用体内外实验明确肝脏摄取KB-LPS 复合物的细胞类型，再明确细胞摄取代谢LPS 的具体方式，为阐明与外源性物质结合的LPS的降解和清除途径、获得新的药物靶点奠定基础。项目研究结果显示，KB/LPS复合物的形成，促进了小鼠外周血中LPS的清除，且该现象与KB增加LPS在肝脏的富集密切相关。进而我们观察到肝KB/LPS复合物注射后，与肝细胞共定位增加，与肝kupffer细胞共定位减少。体外培养的原代肝细胞对KB/LPS复合物的摄取作用增加，而肝kupffer细胞对KB/LPS复合物受到明显抑制。同时选择性耗损肝kupffer细胞并不影响小鼠肝组织中KB/LPS复合物富集程度，因此肝细胞可能是肝组织参与摄取KB/LPS复合物的主要细胞类型。进一步研究发现，KB选择性上调肝细胞和小鼠肝组织中上去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor , ASGPR）的表达，且ASGPR表达水平与KB/LPS复合物在肝细胞的内化呈明显正相关。采用siRNA干扰肝细胞中ASGPR受体的表达，可抑制肝细胞对KB/LPS复合物的摄取。我们还观察到，KB可与ASGPR发生直接的结合作用，并通过该方式将LPS带入肝细胞中，最后经内体-溶酶体途径被降解、清除。我们在研究中还发现，KB还可影响小鼠体内胆汁酸代谢，并可能经改方式介导肝细胞内LPS的摄取和排泄。此外，KB/LPS复合物的形成可显著抑制LPS刺激所引发的小鼠肝组织/肝细胞的炎症反应，同时KB除介导LPS内化清除外，还可通过ASGPR途径上调肝细胞的自噬水平，上述作用均有助于改善LPS所致小鼠肝损伤，也可能是其除直接中和清除LPS外，对脓毒症治疗作用的新机制。