建立HCV 6a亚型细胞培养系统研究NS5A/C-E2对复制和抗病毒应答的影响机制

The number of chronic hepatitis C(CHC) patients infected with HCV genotype 6a is rapidly increasing in Southern China and elsewhere. We have established a cohort study of CHC patients infected by HCV 6a and the database of samples. The various recombinant plasmids contained structural genes or nonstructural genes of HCV 6a were constructed. Different HCV genotypes with the different characteristics of replication and responses to the antiviral therapies have fully reported. What are the key viral sequence and its mechanism? We will use the structure-gene and nonstructure-gene of genotype 6a to replace the related regions of JFH1 (2a) that showed robust replication ability in cell culture system, and to construct two 6a/2a chimeras. After transfecting into Huh7.5 cell lines with the RNA from the chimeras, obtaining chimera strains containing cell culture-adaptive mutations, we will further establish the whole genomic cell culture system of HCV 6a with the strategy of promoting the replication enhancing mutations and stablizing the hypervariable regions of E1/E2. With these cell culture systems, the mechanism of HCV NS5A/C-E2 regions influencing on viral replication and host immunological response will be elucidated. The study will provide experimental and theoretical evidences for the analysis of biological features, immunological characteristics, and contribute to the vaccine development and screening new drug against HCV 6a infection.

HCV 6a所致的慢性丙型肝炎在华南等地呈快速增长趋势。我们已经建立了HCV 6a患者研究队列和标本库，构建了多种HCV6a结构基因和非结构基因质粒。HCV不同的基因型具有明显不同的复制与抗病毒应答特点，其关键序列和机制是什么？本项目利用JFH1（2a）可高效细胞培养的特性，以JFH1序列为骨架，用6a的结构基因和非结构基因分别置换JFH1相应基因区，构建两种6a/2a嵌合体质粒，转染Huh7.5细胞，用促进复制相关的适应性突变发生与保持感染性相关E1/E2不变的策略，建立HCV 6a全基因细胞培养系统。随后建立6a/2a/1b 三种亚型的比较分析系统，分析不同基因型以及临床上不同应答结局病人HCV NS5A/C-E2等关键序列对复制和抗病毒应答的影响；阐明华南高流行HCV 6a病毒株的生物学特点、相关免疫学特征，同时为疫苗研制、抗病毒药物的评价和筛选等提供分析平台。

华南HCV 6a 亚型感染率居全国首位，在人群中传播速度较快，并有向全国蔓延的态势，是我国丙型肝炎防治工作新的挑战。由于HCV6a 亚型的防治有其自身的特点，立项时缺乏HCV 6a细胞培养模型。故本项目对华南HCV6a 亚型的细胞培养模型及其生物学特性，结合国际上研究进展、临床相关的突出基础问题进行了深入研究。.1）建立了高效复制的全长感染性HCV 6a细胞培养模型CH6acc.按项目计划从3例慢性丙型肝炎患者血清中成功扩增、鉴定了具备完整Core-NS2区域的6a亚型的病毒基因大片段克隆。通过与HCV JFH1株嵌合后转染Huh7.5.1细胞。经引入一系列适应性突变以及我们联合团队探索出的适应性突变，最终得到了三株高效复制的6a Core-NS2/JFH1嵌合病毒，在Huh7.5细胞内滴度为10E+3.74-10E+4.05FFU/mL。随后，我们分4段扩增了HCV6a全基因组序列，获得包含60-9571核苷酸的HCV 6a毒株的全基因组克隆，定名为HCV CH6a；用HCV 6a的NS3-3UTR取代前述嵌合病毒中的JFH1序列，引入前述适应性突变，将此全长HCV6a克隆命名为CH6a，进而建立了高效复制的全长感染性CH6a细胞培养系统，命名为CH6acc。转染CH6a_ORF_26m和CH6a_FL_26m两个克隆，细胞可以在一周左右达到感染高峰，上清滴度分别为10E+4.6 FFU/mL和10E+4.3 FFU/mL。.2）建立了HCV 6a的复制子(replicon)细胞培养模型.获得CH6a全长毒株的复制模型后，用CH6a构建了CH6a的复制子系统，命名为SGR-CH6a （带新霉素筛选基因和EMCV的IRES）。转染Huh7.5.1-VISI-GFP细胞后，经筛选后得到了高效持续表达SGR-CH6a-Neo的Huh7.5.1-VISI细胞培养模型，SGR-CH6a RNA拷贝数达到10E+9.8拷贝/μg RNA。用此复制子模型，检测了Daclatasvir和Sofosbuvir药物的敏感性，效果良好。.HCV 6a毒株细胞培养模型和复制子细胞培养模型的成功建立，为HCV 6a亚型治疗新型药物筛选、耐药位点分析、适应性突变在病毒生活史中的作用，以及深入探索HCV的致病和致癌机制、疫苗制备等研究提供了重要的实验材料与研究平台。