晚期氧化蛋白产物诱导破骨细胞分化的作用及其机制

破骨细胞在类风湿性关节炎（RA）骨质损害过程中发挥重要作用。晚期氧化蛋白产物(AOPP)在RA患者体内蓄积。预实验显示AOPP 可诱导破骨细胞分化，但其分子机制尚不清楚。据此，我们提出假说：体内蓄积的AOPP能通过细胞表面受体RAGE介导，活化NADPH氧化酶，促进活性氧生成，激活MAPK和NF-κB信号通路，诱导破骨细胞分化，参与RA骨质损害。为证实上述假说，本项目拟以破骨细胞前体RAW264.7细胞为模型，采用实时定量PCR、Western blot 、免疫荧光等方法，进一步观察 AOPP诱导破骨细胞分化的作用，研究AOPP 作用的受体途径对NADPH氧化酶活化及其下游信号通路激活的影响，探讨阻断受体介导的信号通路对AOPP诱导破骨细胞分化的影响。本项目将从受体、信号分子及分化效应三方面阐明AOPP诱导破骨细胞分化的作用及机制，有望为进一步探索RA骨质损害的机制及其防治开辟新途径。

破骨细胞是由多个单核细胞(破骨细胞前体)分化融合而成的多核细胞，具有特殊的骨吸收功能。破骨细胞的功能增强，导致骨量丢失增加，易形成骨质疏松。类风湿性关节炎（RA）患者常伴有全身性骨质疏松及关节周围的骨质损害，这些病理改变与破骨细胞密切相关。晚期氧化蛋白产物(AOPP)是蛋白质氧化损伤产物，在RA患者体内蓄积。我们前期证实AOPP体外可抑制成骨样细胞的分化。本项目旨在研究AOPP对破骨细胞分化的作用及其分子机制。通过体外制备AOPP，以破骨细胞前体RAW264.7细胞为模型，研究证实：⑴ AOPP刺激RAW264.7细胞，可促进抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色阳性多核细胞形成，增加细胞TRAP 活性，上调破骨细胞特异性基因TRAP、组织蛋白酶（CTS）-K、基质金属蛋白酶(MMP）-9表达；⑵AOPP可促使细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH） 氧化酶的胞浆内亚基p47phox向胞膜转移，并且增加与胞膜亚基Nox2 和p22phox结合；⑶ AOPP可增加细胞内活性氧（ROS）水平，且NADPH 氧化酶抑制剂 （DPI 和apocynin），氧自由基清除剂如超氧物歧化酶(SOD)，N - 乙酰半胱胺酸(NAC)，过氧化氢酶（CAT）可降低AOPP诱导的ROS生成；⑷ AOPP可诱导有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）p38、ERK1/2磷酸化，但对JNK无激活作用，也可诱导核因子（NF）-κB p65磷酸化；此外， DPI、apocynin、NAC、CAT和SOD 预处理可阻断AOPP诱导的MAPK、NF-κB信号分子磷酸化；⑸ DPI、Apocynin、NAC、CAT、 SOD 、p38特异抑制剂SB203580、ERK1/2 特异抑制剂U0126和NF-κB特异抑制剂BAY11-7082可抑制AOPP诱导的TRAP染色阳性多核细胞增加、细胞TRAP 活性增加及TRAP、CTS-K及MMP-9基因表达增加。因此，AOPP 通过激活NAPDH氧化酶依赖的ROS--MAPK、 NF-κB的信号途径诱导破骨细胞前体RAW264.7细胞向破骨细胞分化。本项目阐明了AOPP诱导破骨细胞分化的作用及机制，有望为进一步探索RA骨质疏松和骨质损害的机制及其防治开辟新途径。